番木瓜凝乳蛋白酶基因的克隆及其对嗜酸乳杆菌的转化
| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-10页 |
| 第1章 绪论 | 第10-16页 |
| ·研究的目的和意义 | 第10页 |
| ·天然凝乳酶的研究与应用进展 | 第10-12页 |
| ·动物性凝乳酶 | 第10-11页 |
| ·植物性凝乳酶 | 第11页 |
| ·微生物凝乳酶 | 第11-12页 |
| ·重组凝乳酶的研究进展 | 第12-13页 |
| ·乳酸菌作为宿主菌表达外源蛋白的研究进展 | 第13-14页 |
| ·嗜酸乳杆菌的研究进展 | 第14-15页 |
| ·主要研究内容 | 第15-16页 |
| ·番木瓜凝乳蛋白酶基因的克隆 | 第15页 |
| ·重组质粒的构建 | 第15页 |
| ·重组质粒转化嗜酸乳杆菌 | 第15页 |
| ·重组质粒转化嗜酸乳杆菌的分子检测 | 第15-16页 |
| 第2章 实验材料与方法 | 第16-30页 |
| ·实验材料和仪器 | 第16-20页 |
| ·番木瓜材料 | 第16页 |
| ·宿主菌和载体质粒 | 第16页 |
| ·试剂 | 第16页 |
| ·常用试剂的配制 | 第16-18页 |
| ·培养基的配制 | 第18页 |
| ·主要仪器 | 第18-20页 |
| ·实验方法 | 第20-30页 |
| ·番木瓜总的RNA 的提取 | 第20-21页 |
| ·RNA 琼脂糖凝胶电泳检测 | 第21页 |
| ·估算RNA 溶液的纯度和浓度 | 第21-22页 |
| ·RT-PCR | 第22-24页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第24页 |
| ·DNA 片段的回收与纯化 | 第24-25页 |
| ·大肠杆菌质粒DNA 的制备 | 第25-26页 |
| ·细菌基因组DNA 的提取方法 | 第26页 |
| ·乳酸菌质粒DNA 的制备 | 第26-27页 |
| ·PCR 产物连接T 载体并转化 | 第27页 |
| ·酶切 | 第27-28页 |
| ·T4 连接酶连接 | 第28页 |
| ·电脉冲转化嗜酸乳杆菌ATCC4356 | 第28-29页 |
| ·稳定遗传的检测方法 | 第29-30页 |
| 第3章 番木瓜中凝乳蛋白酶基因的克隆 | 第30-40页 |
| ·番木瓜中总RNA 的提取 | 第30-31页 |
| ·RT-PCR 产物电泳检测 | 第31-32页 |
| ·连接到T 载体并转化大肠杆菌 | 第32页 |
| ·提取质粒DNA 的电泳检测 | 第32-33页 |
| ·质粒PCR 电泳检测 | 第33-34页 |
| ·质粒DNA 酶切的电泳检测 | 第34页 |
| ·DNA 测序 | 第34-35页 |
| ·实验方法的讨论 | 第35-39页 |
| ·提取总RNA | 第35页 |
| ·PCR 扩增 | 第35-39页 |
| ·本章小结 | 第39-40页 |
| 第4章 重组质粒的构建及验证 | 第40-46页 |
| ·质粒pMG36e 的构建背景 | 第40页 |
| ·重组质粒pMG36e 的构建 | 第40-42页 |
| ·重组质粒的PCR 验证 | 第42-43页 |
| ·重组质粒的酶切验证 | 第43-44页 |
| ·实验方法的讨论 | 第44-45页 |
| ·本章小结 | 第45-46页 |
| 第5章 菌株分子水平上的鉴定 | 第46-52页 |
| ·鉴定原理 | 第46-47页 |
| ·菌株基因组DNA 的提取 | 第47-48页 |
| ·PCR 扩增16S rDNA | 第48-50页 |
| ·鉴定转化结果 | 第50页 |
| ·比对测序结果 | 第50页 |
| ·讨论 | 第50-51页 |
| ·本章小结 | 第51-52页 |
| 第6章 重组质粒转化嗜酸乳杆菌 | 第52-58页 |
| ·转化方法的选择 | 第52-53页 |
| ·感受态细胞转化法 | 第52页 |
| ·细胞电脉冲转化法 | 第52-53页 |
| ·原生质体转化法 | 第53页 |
| ·测定嗜酸乳杆菌对红霉素的耐受程度 | 第53-54页 |
| ·电脉冲转化 | 第54页 |
| ·转化子的鉴定 | 第54-56页 |
| ·转化子质粒的直接鉴定 | 第54-55页 |
| ·PCR 鉴定 | 第55页 |
| ·双酶切鉴定 | 第55-56页 |
| ·重组质粒的遗传稳定性检测 | 第56页 |
| ·实验方法的讨论 | 第56-57页 |
| ·本章小结 | 第57-58页 |
| 结论 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-63页 |
| 附录1 | 第63-65页 |
| 附录2 | 第65-66页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第66-69页 |
| 致谢 | 第69页 |
