| 摘要 | 第1-13页 |
| Abstract | 第13-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-33页 |
| 引言 | 第16页 |
| 1 真菌几丁质酶的研究进展 | 第16-31页 |
| ·真菌几丁质酶的组成 | 第17-18页 |
| ·真菌几丁质酶的产生 | 第18-20页 |
| ·产几丁质酶真菌的筛选 | 第18-19页 |
| ·真菌几丁质酶的产生条件 | 第19-20页 |
| ·真菌几丁质酶的基本性质 | 第20-22页 |
| ·真菌几丁质酶基因的分子生物学研究 | 第22-29页 |
| ·真菌几丁质酶基因的克隆 | 第22-23页 |
| ·真菌几丁质酶基因的结构 | 第23-26页 |
| ·真菌几丁质酶基因的表达调控 | 第26-27页 |
| ·真菌几丁质酶基因的表达转化 | 第27-28页 |
| ·真菌几丁质酶的空间结构和催化功能 | 第28-29页 |
| ·真菌几丁质酶的应用 | 第29-30页 |
| ·几丁质酶在生物学研究方面的应用 | 第29页 |
| ·用作生防制剂 | 第29-30页 |
| ·利用几丁质酶降解渔业废物,实现几丁质的生物转化 | 第30页 |
| ·发展趋势 | 第30-31页 |
| 2 本研究的立论依据及研究意义 | 第31-33页 |
| 第二章 疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)热稳定性几丁质酶的纯化及特性 | 第33-53页 |
| 1 材料与方法 | 第33-38页 |
| ·实验材料 | 第33-34页 |
| ·供试菌株 | 第33-34页 |
| ·培养基 | 第34页 |
| ·主要仪器和试剂 | 第34页 |
| ·实验方法 | 第34-38页 |
| ·培养条件 | 第34-35页 |
| ·培养时间对几丁质酶产生的影响 | 第35页 |
| ·酶活力测定 | 第35页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第35页 |
| ·Thermomyces lanuginosus 几丁质酶的分离纯化 | 第35-36页 |
| ·SDS-PAGE 测定蛋白质分子量和纯度鉴定 | 第36页 |
| ·N-端氨基酸测定 | 第36页 |
| ·几丁质酶酶学特性的研究 | 第36-38页 |
| 2 结果与分析 | 第38-48页 |
| ·不同培养时间对几丁质酶活性的影响 | 第38-39页 |
| ·酶的分离纯化 | 第39-42页 |
| ·DEAE-Sepharose 阴离子交换柱层析 | 第39页 |
| ·Phenyl-Sepharose 疏水柱层析 | 第39-40页 |
| ·几丁质酶纯化过程总表 | 第40-41页 |
| ·几丁质酶分子量和纯度鉴定 | 第41-42页 |
| ·几丁质酶的特性研究 | 第42-46页 |
| ·最适反应温度 | 第42-43页 |
| ·最适反应pH | 第43页 |
| ·酶的热稳定性 | 第43页 |
| ·酶的pH 稳定性 | 第43-44页 |
| ·不同金属离子对酶活性的影响 | 第44页 |
| ·变性剂和蛋白酶抑制剂对几丁质酶活性的影响 | 第44-45页 |
| ·几丁质酶的反应动力学曲线 | 第45-46页 |
| ·N-端氨基酸序列测定 | 第46页 |
| ·几丁质酶的储存稳定性 | 第46-47页 |
| ·酶的抗菌活性 | 第47-48页 |
| 3 讨论 | 第48-53页 |
| ·Thermomyces lanuginosus 几丁质酶的纯化方法 | 第48-50页 |
| ·Thermomyces lanuginosus 几丁质酶的稳定性 | 第50-51页 |
| ·Thermomyces lanuginosus 几丁质酶活性与金属离子的关系 | 第51页 |
| ·Thermomyces lanuginosus 几丁质酶的抗菌活性 | 第51-52页 |
| ·Thermomyces lanuginosus 几丁质酶的应用潜力和存在的问题 | 第52-53页 |
| 第三章 嗜热真菌热稳定性几丁质酶基因的cDNA 克隆及其序列分析 | 第53-84页 |
| 1 材料和方法 | 第53-64页 |
| ·材料 | 第53-56页 |
| ·供试菌株 | 第53页 |
| ·菌株与质粒 | 第53-54页 |
| ·酶和生化试剂 | 第54页 |
| ·仪器 | 第54页 |
| ·培养基 | 第54页 |
| ·溶液配制 | 第54-55页 |
| ·PCR 引物 | 第55-56页 |
| ·实验方法 | 第56-64页 |
| ·总RNA 的提取(Trizol 法) | 第56页 |
| ·紫外检测RNA 产率和纯度 | 第56页 |
| ·反转录cDNA 第一链的合成 | 第56-57页 |
| ·目的基因cDNA 中间片段的分离 | 第57-61页 |
| ·目的基因3’末端的分离(3’-RACE) | 第61-62页 |
| ·目的基因5’末端的分离(5’-RACE) | 第62-64页 |
| ·目的基因全长cDNA 的克隆 | 第64页 |
| ·全长序列的生物信息学分析 | 第64页 |
| 2 结果与分析 | 第64-79页 |
| ·Thermomyces lanuginosus 总RNA 的提取 | 第64-65页 |
| ·几丁质酶基因中间片段的分离 | 第65-68页 |
| ·Thermomyces lanuginosus 几丁质酶基因中间片段的分离 | 第65-66页 |
| ·Thermoascus aurantiacus 几丁质酶基因片断的克隆及序列分析 | 第66-68页 |
| ·Thermomyces lanuginosus 几丁质酶基因3’-末端cDNA 的分离 | 第68-69页 |
| ·Thermomyces lanuginosus 几丁质酶基因cDNA 5’-末端的分离 | 第69-71页 |
| ·Thermomyces lanuginosus 几丁质酶基因全长cDNA 的分离及扩增片断的序列拼接 | 第71-72页 |
| ·几丁质酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析 | 第72-79页 |
| ·几丁质酶基因chit 的核苷酸序列分析 | 第74-75页 |
| ·几丁质酶基因chit 的氨基酸序列分析 | 第75-77页 |
| ·几丁质酶氨基酸组成 | 第77-78页 |
| ·几丁质酶CHIT 的二级结构预测 | 第78-79页 |
| 3 讨论 | 第79-84页 |
| ·利用RACE 技术分离功能基因 | 第79-81页 |
| ·Thermomyces lanuginosus 几丁质酶chit 基因结构探讨 | 第81-84页 |
| 第四章 Thermomyces lanuginosus 热稳定几丁质酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达 | 第84-120页 |
| 1 材料和方法 | 第84-96页 |
| ·材料 | 第84-86页 |
| ·菌株和质粒 | 第84页 |
| ·酶和生化试剂 | 第84-85页 |
| ·培养基及有关溶液的配制 | 第85-86页 |
| ·主要仪器设备 | 第86页 |
| ·试验方法 | 第86-96页 |
| ·几丁质酶CHIT 成熟肽基因序列的分离 | 第86-87页 |
| ·几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达 | 第87-88页 |
| ·几丁质酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第88-96页 |
| 2 结果与分析 | 第96-114页 |
| ·几丁质酶成熟肽基因序列的分离 | 第96-97页 |
| ·几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达 | 第97-100页 |
| ·几丁质酶基因重组表达载体的构建 | 第97-98页 |
| ·几丁质酶基因的诱导表达 | 第98-99页 |
| ·表达蛋白的可溶性分析 | 第99-100页 |
| ·几丁质酶基因chit 在毕赤酵母中的表达 | 第100-114页 |
| ·酵母表达载体的构建和鉴定 | 第100-103页 |
| ·重组酵母表达质粒pPIC9K/chit 转化 Pichia pastoris GS115 及酵母转化子的筛选 | 第103-107页 |
| ·疏绵状嗜热丝孢菌热稳定几丁质酶chit 基因在Pichia pastoris 中的高效表达及表达产物的检测 | 第107-114页 |
| 3 讨论 | 第114-120页 |
| ·外源chit 基因在E. coli 中的表达 | 第114页 |
| ·影响Pichia pastoris 表达系统表达重组几丁质酶的因素 | 第114-118页 |
| ·表达几丁质酶的酶学特性 | 第118-120页 |
| 第五章 结论和建议 | 第120-122页 |
| ·结论 | 第120-121页 |
| ·建议 | 第121-122页 |
| 参考文献 | 第122-142页 |
| 致谢 | 第142-143页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第143页 |
