| 1 前言 | 第1-23页 |
| 1．1 白桦的地理分布和强化育种研究的现状 | 第8-9页 |
| 1．2 高等植物成花过程及成花基因 | 第9-18页 |
| 1．2．1 影响高等植物成花的外界因素 | 第9-10页 |
| 1．2．1．1 光周期对成花的作用 | 第10页 |
| 1．2．1．2 春化作用对成花的作用 | 第10页 |
| 1．2．1．3 成花感受态 | 第10页 |
| 1．2．2 控制成花的相关基因 | 第10-18页 |
| 1．2．2．1 成花计时基因 | 第11-15页 |
| 1．2．2．2 花形态决定基因—同源异型框基因 | 第15-18页 |
| 1．3 强化条件下白桦提早开花结实基因调控机理研究技术路线的确定 | 第18页 |
| 1．4 特异性表达基因分离技术 | 第18-22页 |
| 1．4．1 初期的特异性基因克隆技术 | 第18-19页 |
| 1．4．2 PCR技术运用到基因克隆技术后的特异性基因分离技术 | 第19-20页 |
| 1．4．2．1 差别显示技术 | 第19-20页 |
| 1．4．2．2 抑制性扣除杂交技术 | 第20页 |
| 1．4．3． 生物信息学时代的基因克隆技术 | 第20-22页 |
| 1．4．3．1 表达序列标签技术 | 第20-21页 |
| 1．4．3．2 同源序列基因克隆技术 | 第21页 |
| 1．4．3．3 基因表达的序列分析技术 | 第21-22页 |
| 1．4．3．4 DNA芯片技术 | 第22页 |
| 1．5 强化条件下白桦提早开花结实基因调控机理研究方法的确定 | 第22页 |
| 1．6 研究的目的和意义 | 第22-23页 |
| 2． 材料和方法 | 第23-37页 |
| 2．1 实验试剂和设备 | 第23-24页 |
| 2．1．1 植物RNA提取试剂 | 第23页 |
| 2．1．1．1 2×CTAB多级沉淀法提取试剂 | 第23页 |
| 2．1．1．2 CTAB—DNA酶消化法试剂 | 第23页 |
| 2．1．1．3 SDS—DNA酶消化法试剂 | 第23页 |
| 2．1．2 mRNA分离试剂 | 第23页 |
| 2．1．3 LB培养基 | 第23-24页 |
| 2．1．4 质粒提取试剂 | 第24页 |
| 2．1．5 蔗糖、溴酚蓝溶液 | 第24页 |
| 2．1．6 50×TAE | 第24页 |
| 2．1．7 酶和其他生化试剂 | 第24页 |
| 2．1．8 主要仪器设备 | 第24页 |
| 2．2 实验材料 | 第24-25页 |
| 2．3 本项研究的技术路线 | 第25-26页 |
| 2．4 实验方法 | 第26-37页 |
| 2．4．1 白桦花芽组织总RNA的提取 | 第26-27页 |
| 2．4．1．1 CTAB多级沉淀法 | 第26页 |
| 2．4．1．2 CTAB—DNA酶消化法 | 第26-27页 |
| 2．4．1．3 SDS—DNA酶消化法 | 第27页 |
| 2．4．2 白桦花芽组织mRNA快速分离 | 第27-29页 |
| 2．4．2．1 准备工作 | 第27页 |
| 2．4．2．2 清洗SA-PMS | 第27-28页 |
| 2．4．2．3 探针的退火 | 第28页 |
| 2．4．2．4 捕获和清洗 | 第28页 |
| 2．4．2．5 mRNA的洗脱 | 第28页 |
| 2．4．2．6 沉淀和浓缩mRNA | 第28-29页 |
| 2．4．3 cDNA第一链的合成 | 第29页 |
| 2．4．4 RT-PCR简并引物的设计 | 第29-33页 |
| 2．4．4．1 常规简并引物设计 | 第29-30页 |
| 2．4．4．2 本实验简并引物的设计 | 第30-32页 |
| 2．4．4．3 CO基因克隆引物设计 | 第32-33页 |
| 2．4．4．4 AG基因克隆简并引物的设计 | 第33页 |
| 2．4．5 白桦RT-PCR实验体系的建立 | 第33-35页 |
| 2．4．5．1 反应体系的优化 | 第33-35页 |
| 2．4．5．2 按程序2对设计出7对简并引物进行初步筛选 | 第35页 |
| 2．4．6 回收片段的克隆 | 第35-36页 |
| 2．4．6．1 回收片段的纯化 | 第35页 |
| 2．4．6．2 纯化产物与pMD18-T Vector连接 | 第35-36页 |
| 2．4．6．3 连接产物的转化 | 第36页 |
| 2．4．7 转化菌质粒的提取 | 第36-37页 |
| 2．4．8 克隆产物的PCR鉴定 | 第37页 |
| 2．4．9 重组质粒的保存 | 第37页 |
| 2．4．10 克隆片段的序列测序分析 | 第37页 |
| 3 结果与分析 | 第37-52页 |
| 3．1 几种白桦雄花芽RNA提取方法的比较 | 第37-41页 |
| 3．1．1 RNA完整性的检测 | 第37-39页 |
| 3．1．1．1 CTAB多级沉淀法提取的RNA完整性检测 | 第37-38页 |
| 3．1．1．2 TRIzoL Reagent、CTAB—DNA酶消化法和SDS—DNA酶消化法提取RNA完整性检测 | 第38-39页 |
| 3．1．2 RNA浓度与纯度的测定 | 第39页 |
| 3．1．2．1 CTAB多级沉淀法提取的RNA浓度与纯度的测定 | 第39页 |
| 3．1．2．2 CTAB—DNA酶消化法和SDS—DNA酶消化法提取的RNA浓度与纯度的测定 | 第39页 |
| 3．1．3 白桦雄花芽RNA提取方法的分析 | 第39-41页 |
| 3．2 简并引物的筛选 | 第41页 |
| 3．2．1 简并引物的初步筛选 | 第41页 |
| 3．2．2 简并引物最后确定 | 第41页 |
| 3．3 反转录体系的确立 | 第41-42页 |
| 3．4 RT-PCR反应体系的确立 | 第42-45页 |
| 3．4．1 cDNA用量对扩增实验结果的影响 | 第42-44页 |
| 3．4．2 dNTPs用量的确定 | 第44页 |
| 3．4．3 引物浓度的确定 | 第44-45页 |
| 3．4．4 扩增程序确定 | 第45页 |
| 3．5 RT—PCR反应体系的确定以及产物的扩增 | 第45-46页 |
| 3．6 片段回收 | 第46页 |
| 3．7 回收产物与T载体的连接 | 第46-47页 |
| 3．8 连接产物的转化 | 第47页 |
| 3．9 转化细菌的质粒提取 | 第47-48页 |
| 3．10 克隆质粒的PCR鉴定结果 | 第48页 |
| 3．11 对克隆片段的序列分析结果 | 第48-52页 |
| 3．11．1 分子量最大的片段阳性转化子质粒插入片段测序结果 | 第48-50页 |
| 3．11．1．1 片段序列在NCBI数据库中做BLASTX比较结果 | 第48-50页 |
| 3．11．1．2 序列的蛋白三维结果预测结果 | 第50页 |
| 3．11．2 分子量小的两条片段测序结果 | 第50-52页 |
| 3．11．2．1 分子量较小段测序结果 | 第50-51页 |
| 3．11．2．2 分子量最小的两条片段测序结果 | 第51-52页 |
| 4 讨论 | 第52-56页 |
| 4．1 如何确定强化条件下白桦花芽组织的取材时间与部位 | 第52-53页 |
| 4．2 影响RT-PCR技术的几个关键因素 | 第53-55页 |
| 4．2．1 生物信息学知识恰当应用 | 第53-54页 |
| 4．2．1．1 多重比较序列如何确定 | 第53页 |
| 4．2．1．2 简并引物的选择标准 | 第53-54页 |
| 4．2．2 高效逆转录体系的建立 | 第54页 |
| 4．2．3 影响RT—PCR体系的因素 | 第54-55页 |
| 4．3 RT—PCR的可信度 | 第55页 |
| 4．4 影响扩增产物克隆与测序的因素 | 第55页 |
| 4．5 测序片段结构确定 | 第55-56页 |
| 5 结论与建议 | 第56-58页 |
| 5．1 白桦花芽组织取材时间的确定 | 第56页 |
| 5．2 提出3种白桦花芽组织RNA提取方法 | 第56页 |
| 5．3 建立了白桦花芽组织RNA的逆转录体系 | 第56页 |
| 5．4 筛选出一对克隆白桦成花计时基因的简并引物 | 第56-57页 |
| 5．5 初步建立了克隆白桦成花计时基因克隆的RT-PCR技术体系 | 第57页 |
| 5．6 利用生物信息知识对克隆出3条特异性片段做了初步分析并得到初步结果 | 第57页 |
| 5．7 强化条件下白桦提早开花结实基因调控机理研究对象应做适当改变 | 第57页 |
| 5．8 强化条件下白桦提早开花结实基因调控机理研究的新设想 | 第57-58页 |
| 参考文献： | 第58-63页 |
| 致谢 | 第63页 |
