| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-13页 |
| 第一章 综述 | 第13-34页 |
| ·纤维素酶 | 第15-19页 |
| ·纤维素酶的命名 | 第15-17页 |
| ·纤维素酶的性质,与瑞氏木霉的纤维素酶 | 第17-19页 |
| ·纤维素酶在酵母中的异源表达 | 第19-26页 |
| ·纤维素酶在酿酒酵母中表达 | 第20-22页 |
| ·纤维素酶在毕赤氏酵母中表达 | 第22-26页 |
| ·纤维素外切酶Cel7A在酵母中异源表达的N-糖基化情况 | 第26-30页 |
| ·瑞氏木霉中Cel7A的糖基化 | 第27-28页 |
| ·Cel7A在酵母中的糖基化 | 第28-30页 |
| ·致突变菌 | 第30-32页 |
| ·本研究的目的与主要工作内容 | 第32-34页 |
| 第二章 外切纤维素酶Cel7A的糖基化位点改造 | 第34-51页 |
| ·材料与方法 | 第35-41页 |
| ·菌株和质粒 | 第35页 |
| ·酶和试剂 | 第35页 |
| ·培养基和溶液 | 第35-36页 |
| ·菌种活化,提取质粒 | 第36页 |
| ·点突变引物的设计 | 第36页 |
| ·点突变方法 | 第36-40页 |
| ·Cel7A基因及其突变体N45S/N64S/N270S/N384S的PCR扩增条件 | 第40-41页 |
| ·结果与讨论 | 第41-50页 |
| 结论 | 第50-51页 |
| 第三章 Cel7A及其突变体在毕赤酵母中的表达与研究 | 第51-76页 |
| ·材料与方法 | 第51-61页 |
| ·菌株和质粒 | 第51页 |
| ·工具酶、试剂和仪器 | 第51-52页 |
| ·培养基和溶液 | 第52-54页 |
| ·载体质粒pPIC9K的提取,目的基因与载体的限制性内切酶消化反应 | 第54-55页 |
| ·线状载体质粒pPIC9K的去磷酸化处理,目的基因与载体的连接反应 | 第55页 |
| ·连接液的乙醇沉淀 | 第55-56页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备,电击转化 | 第56-57页 |
| ·大肠杆菌转化子的验证 | 第57页 |
| ·重组质粒的线性化 | 第57-58页 |
| ·毕赤酵母电转化 | 第58页 |
| ·外源蛋白的诱导表达 | 第58-59页 |
| ·胞外蛋白表达情况的SDS-PAGE检测 | 第59-60页 |
| ·酶活性测定 | 第60页 |
| ·粗酶液的制备 | 第60-61页 |
| ·超滤浓缩 | 第61页 |
| ·离子交换层析 | 第61页 |
| ·Cel7A的三级结构模拟,残基暴露表面积和相邻残基数目的计算 | 第61页 |
| ·结果与讨论 | 第61-75页 |
| ·Cel7A及其突变体在酵母中异源表达的重组质粒的构建 | 第61-66页 |
| ·Cel7A及其突变子在毕赤氏酵母中表达与酶活的比较研究 | 第66-71页 |
| ·Cel7A及其四个糖基化位点的三级结构分析 | 第71-75页 |
| 结论 | 第75-76页 |
| 第四章 酿酒酵母致突变菌株的构建及性质研究 | 第76-99页 |
| ·材料与方法 | 第77-88页 |
| ·菌株和质粒 | 第77页 |
| ·工具酶和试剂 | 第77页 |
| ·培养基和溶液 | 第77-78页 |
| ·敲除片段获得和纯化 | 第78-80页 |
| ·敲除片断电转化酿酒酵母 | 第80页 |
| ·转化子验证 | 第80-81页 |
| ·致突变菌株生长情况的测定 | 第81-82页 |
| ·不同H_2O_2浓度诱导条件下致突变菌株存活率的测定 | 第82-83页 |
| ·构建kanamycin抗性报告质粒 | 第83-87页 |
| ·致突变菌株kanamycin抗性回复突变率的测定 | 第87-88页 |
| ·结果与分析 | 第88-97页 |
| ·致突变菌株构建 | 第88页 |
| ·致突变菌的生长情况研究 | 第88-89页 |
| ·不同浓度双氧水处理下的RDKY3615(△CTT)和RDKY3615(△SOD)的存活率 | 第89-90页 |
| ·回复突变率测定的kanamycin抗性报告质粒的构建 | 第90-95页 |
| ·kanamycin抗性基因回复突变率的测定 | 第95-97页 |
| 结论 | 第97-99页 |
| 第五章 Cel5A在致突变菌株中的突变与高酶活突变株的筛选 | 第99-114页 |
| ·材料与方法 | 第99-105页 |
| ·菌株和质粒 | 第100页 |
| ·工具酶、试剂和仪器 | 第100-101页 |
| ·培养基和溶液 | 第101页 |
| ·表达质粒pGADT7—Cel5A的构建,酶切验证 | 第101-103页 |
| ·pGADT7—Cel5A转化酿酒酵母致突变菌株 | 第103页 |
| ·SDS电泳检测发酵液中内切酶 | 第103-104页 |
| ·活性染色 | 第104页 |
| ·双氧水处理突变 | 第104页 |
| ·刚果红染色平板筛选高酶活突变株 | 第104-105页 |
| ·内切酶酶活性测定 | 第105页 |
| ·结果与分析 | 第105-113页 |
| ·瑞氏木霉内切纤维素酶Cel5A在致突变菌中的表达 | 第105-108页 |
| ·表达有Cel5A的大水解圈致突变菌突变子的筛选 | 第108-109页 |
| ·表达有Cel5A的大水解圈致突变菌突变子的酶活性测定 | 第109-110页 |
| ·致突变菌发酵液的SDS电泳与活性染色 | 第110-111页 |
| ·高酶活突变子的比酶活比较及基因测序 | 第111-113页 |
| 结论 | 第113-114页 |
| 全文总结与展望 | 第114-116页 |
| 1 本论文取得的创新性结果 | 第114-115页 |
| 2 本论文存在的问题及深入方向 | 第115-116页 |
| 参考文献 | 第116-129页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第129-130页 |
| 致谢 | 第130-131页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第131页 |
