| 摘要 | 第1-8页 |
| ABSTRACT | 第8-12页 |
| 目录 | 第12-15页 |
| 缩写词简表 | 第15-17页 |
| 前言 | 第17-23页 |
| 抑瘤基因NGX6编码跨膜蛋白 | 第17-18页 |
| NGX6功能研究概况 | 第18-19页 |
| NGX6上游分子事件的前期研究 | 第19-23页 |
| 技术路线 | 第23-25页 |
| 第一部分 NGX6启动子区顺式作用元件和反式作用因子的鉴定及功能研究 | 第23-24页 |
| 第二部分 DNA甲基化与NGX6基因表达的相关性研究 | 第24-25页 |
| 第一章 NGX6启动子区顺式作用元件和反式作用因子的鉴定及功能研究 | 第25-61页 |
| 第一节 材料和方法 | 第25-38页 |
| 1. 材料与试剂 | 第25-29页 |
| ·主要实验仪器 | 第25页 |
| ·细胞 | 第25页 |
| ·菌株和载体 | 第25-26页 |
| ·试剂 | 第26-27页 |
| ·自配试剂 | 第27页 |
| ·抗体 | 第27-28页 |
| ·试剂盒 | 第28页 |
| ·引物 | 第28-29页 |
| ·探针 | 第29页 |
| ·siRNA | 第29页 |
| 2. 方法 | 第29-38页 |
| ·NGX6基因调控区转录因子结合位点的生物信息学分析 | 第29页 |
| ·细胞培养 | 第29页 |
| ·构建荧光素酶重组体 | 第29-30页 |
| ·构建启动子绿色荧光蛋白重组体 | 第30页 |
| ·构建pEGFP/Sp1和pEGFP/Egr-1真核表达质粒 | 第30页 |
| ·基因瞬时转染 | 第30-31页 |
| ·质粒DNA的无菌处理 | 第30-31页 |
| ·基因转染与瞬时表达 | 第31页 |
| ·荧光素酶活性分析 | 第31-32页 |
| ·荧光素酶活性检测 | 第31-32页 |
| ·β-半乳糖苷酶活性检测 | 第32页 |
| ·荧光素酶活性相对值处理及其数据分析 | 第32页 |
| ·绿色荧光蛋白活体表达水平检测 | 第32页 |
| ·细胞总RNA的抽提 | 第32页 |
| ·差异RT-PCR | 第32-33页 |
| ·实时定量PCR(Real time-PCR) | 第33-34页 |
| ·细胞核蛋白的提取 | 第34页 |
| ·凝胶电泳迁移率实验 | 第34-35页 |
| ·染色质免疫共沉淀实验 | 第35-37页 |
| ·Western Blotting分析 | 第37-38页 |
| 第二节 结果 | 第38-54页 |
| 1. 定位NGX6基因最小启动子片段 | 第38-39页 |
| 2. 利用绿色荧光蛋白报告载体验证NGX6基因最小启动子片段的启动活性 | 第39-41页 |
| 3. 凝胶电泳迁移率实验确定NGX6最小启动子区的反式作用因子 | 第41-43页 |
| 4. ChIP验证NGX6基因最小启动子区存在转录因子Sp1和Egr-1的结合位点 | 第43页 |
| 5. NGX6基因和转录因子Egr-1在结肠癌细胞中的表达 | 第43-45页 |
| 6. 构建真核表达载体pEGFP-C2/Egr-1 | 第45-46页 |
| 7. 转录因子Egr-1能够增强NGX6基因启动子活性 | 第46-48页 |
| 8. 过表达转录因子Egr-1能上调NGX6基因的mRNA表达水平 | 第48-49页 |
| 9. 封闭内源性Egr-1的表达能降低NGX6基因的mRNA表达水平 | 第49页 |
| 10. 信号通路抑制剂PD98059对转录因子Egr-1以及NGX6基因的影响 | 第49-51页 |
| 11. 转录因子Sp1增强NGX6启动子活性 | 第51-53页 |
| 12. 封闭内源性Sp1的表达能降低NGX6基因的mRNA表达水平 | 第53-54页 |
| 第三节 讨论 | 第54-61页 |
| 第二章 DNA甲基化与NGX6基因转录调控 | 第61-85页 |
| 第一节 材料与方法 | 第61-67页 |
| 1. 材料与试剂 | 第61-62页 |
| ·主要实验仪器 | 第61页 |
| ·细胞 | 第61页 |
| ·菌株和载体 | 第61-62页 |
| ·结直肠组织标本 | 第62页 |
| ·试剂 | 第62页 |
| 2. 方法 | 第62-67页 |
| ·NGX6基因5’上游调控区CpG岛的甲基化位点的生物信息学分析 | 第62页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第62-63页 |
| ·基因组DNA的重亚硫酸钠修饰 | 第63页 |
| ·甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)的引物设计及反应参数 | 第63-64页 |
| ·结合重亚硫酸盐的测序法的引物设计及反应参数 | 第64页 |
| ·BSP产物的序列分析 | 第64-66页 |
| ·胶回收BSP产物 | 第64-65页 |
| ·BSP产物连接至pGEM T-easy载体 | 第65页 |
| ·连接产物的转化 | 第65页 |
| ·质粒提取 | 第65-66页 |
| ·酶切鉴定及DNA测序 | 第66页 |
| ·5-脱氧杂氮胞苷处理 | 第66页 |
| ·CpG甲基化酶SssI处理并鉴定 | 第66页 |
| ·统计学分析 | 第66-67页 |
| 第二节 结果 | 第67-79页 |
| 1. Methylator软件分析NGX6基因5’上游调控区CpG岛的甲基化位点 | 第67页 |
| 2. 甲基化特异性PCR检测NGX6基因启动子在结肠癌细胞中的甲基化状态 | 第67-68页 |
| 3. 结直肠癌组织中NGX6基因启动子甲基化频率高于正常结直肠组织 | 第68-71页 |
| 4. BSP检测NGX6基因启动子在结肠癌细胞中的甲基化状态 | 第71-74页 |
| 5. DNA甲基化抑制Sp1/Egr-1结合位点与其相应转录因子结合 | 第74-75页 |
| 6. SssI甲基转移酶使NGX6基因启动子报告载体在结肠癌细胞中失去启动活性 | 第75-77页 |
| 7. 2.5μM的5-脱氧杂氮胞苷能逆转NGX6基因启动子的甲基化状态 | 第77-79页 |
| 第三节 讨论 | 第79-85页 |
| 结论 | 第85-86页 |
| 参考文献 | 第86-94页 |
| 综述一 | 第94-102页 |
| 参考文献 | 第99-102页 |
| 综述二 | 第102-111页 |
| 参考文献 | 第108-111页 |
| 致谢 | 第111-112页 |
| 攻读学位期间主要的研究成果 | 第112页 |
