| 摘要 | 第6-7页 |
| abstract | 第7-8页 |
| 英文缩略表 | 第14-15页 |
| 第一章 引言 | 第15-33页 |
| 1.1 冠状病毒概述 | 第15-17页 |
| 1.2 猪德尔塔冠状病毒 | 第17页 |
| 1.3 PDCoV病原学 | 第17-23页 |
| 1.3.1 PDCoV病毒粒子及基因组结构 | 第17-18页 |
| 1.3.2 PDCoV与 PEDV/TGEV的抗原交叉反应 | 第18页 |
| 1.3.3 PDCoV的细胞培养及传代 | 第18-19页 |
| 1.3.4 PDCoV致病性及组织嗜性 | 第19-21页 |
| 1.3.5 PDCoV的病理生理学 | 第21-22页 |
| 1.3.6 PDCoV发病时间及排毒 | 第22页 |
| 1.3.7 PDCoV致病机制 | 第22-23页 |
| 1.4 PDCoV分子流行病学 | 第23-26页 |
| 1.4.1 德尔塔冠状病毒的发现及遗传演化 | 第23-24页 |
| 1.4.2 PDCoV的感染和流行情况 | 第24-26页 |
| 1.5 PDCoV诊断方法 | 第26-27页 |
| 1.6 冠状病毒入侵机制研究进展 | 第27-28页 |
| 1.7 肠道粘膜免疫机制 | 第28-29页 |
| 1.7.1 肠道粘膜结构及粘膜免疫 | 第28页 |
| 1.7.2 肠道粘膜免疫效应因子 | 第28-29页 |
| 1.7.3 被动免疫及―肠-乳腺-SIgA‖轴 | 第29页 |
| 1.8 中和抗体 | 第29-30页 |
| 1.9 TGEV的被动免疫机制 | 第30-31页 |
| 1.10 PEDV和 TGEV的疫苗免疫策略 | 第31页 |
| 1.11 免疫应答 | 第31-32页 |
| 1.12 本研究的目的意义 | 第32-33页 |
| 第二章 PDCoV NH株致病性研究 | 第33-45页 |
| 2.1 材料和方法 | 第33-35页 |
| 2.1.1 主要实验试剂 | 第33页 |
| 2.1.2 毒株、细胞和抗体 | 第33页 |
| 2.1.3 主要仪器设备 | 第33页 |
| 2.1.4 实验猪 | 第33页 |
| 2.1.5 荧光定量PCR引物及方法建立 | 第33-34页 |
| 2.1.6 拭子中病毒RNA的提取 | 第34页 |
| 2.1.7 组织中病毒RNA的提取(TRIzol法) | 第34页 |
| 2.1.8 PDCoV阴阳性血清的筛选及鉴定 | 第34-35页 |
| 2.1.9 PDCoV全病毒包被的间接ELISA方法的建立 | 第35页 |
| 2.1.10 致病性实验设计 | 第35页 |
| 2.2 结果 | 第35-43页 |
| 2.2.1 基于N基因的荧光定量PCR方法的建立 | 第35-37页 |
| 2.2.1.1 荧光定量标准曲线 | 第35-36页 |
| 2.2.1.2 灵敏性试验 | 第36页 |
| 2.2.1.3 特异性试验 | 第36-37页 |
| 2.2.2 基于PDCoV全病毒的间接ELISA方法的建立 | 第37-38页 |
| 2.2.2.1 间接ELISA方法的具体操作步骤 | 第37页 |
| 2.2.2.2 抗原最佳包被浓度及血清稀释度的确定 | 第37-38页 |
| 2.2.2.3 临界值的确定 | 第38页 |
| 2.2.3 PDCoV NH株第10 代致病性 | 第38-43页 |
| 2.2.3.1 临床症状 | 第38-40页 |
| 2.2.3.2 剖检变化 | 第40页 |
| 2.2.3.3 病理组织变化 | 第40-41页 |
| 2.2.3.4 免疫组织化学及冰冻切片检测抗原分布 | 第41-42页 |
| 2.2.3.5 PDCoV感染后排毒及组织病毒含量 | 第42-43页 |
| 2.3 讨论 | 第43-45页 |
| 第三章 PDCoV入侵机制研究 | 第45-57页 |
| 3.1 材料和方法 | 第45-46页 |
| 3.1.1 细胞、质粒和病毒 | 第45页 |
| 3.1.2 抑制剂 | 第45页 |
| 3.1.3 荧光定量PCR检测细胞内sgNS7a | 第45-46页 |
| 3.1.4 间接免疫荧光 | 第46页 |
| 3.1.5 细胞融合实验 | 第46页 |
| 3.1.6 抑制剂实验 | 第46页 |
| 3.1.7 蛋白酶活性检测 | 第46页 |
| 3.2 结果 | 第46-56页 |
| 3.2.1 标准曲线的建立 | 第46-47页 |
| 3.2.2 抑制剂最佳浓度的确定 | 第47-48页 |
| 3.2.3 PDCoV通过两种方式入侵细胞 | 第48-49页 |
| 3.2.4 CTSL和 CTSB切割活化S蛋白 | 第49页 |
| 3.2.5 下调CTSL和 CTSB的表达抑制病毒的入侵 | 第49-50页 |
| 3.2.6 PDCoV感染对CTSL和 CTSB的影响 | 第50-52页 |
| 3.2.7 过表达CTSL和 CTSB促进病毒的感染 | 第52页 |
| 3.2.8 胰酶可以切割活化PDCoV S蛋白 | 第52-54页 |
| 3.2.9 胰酶处理促进病毒的感染 | 第54-55页 |
| 3.2.10 PDCoV入侵机制 | 第55-56页 |
| 3.3 讨论 | 第56-57页 |
| 第四章 PDCoV灭活苗被动免疫效果评价 | 第57-76页 |
| 4.1 材料和方法 | 第57-60页 |
| 4.1.1 主要实验试剂 | 第57页 |
| 4.1.2 毒株、细胞、质粒和抗体 | 第57页 |
| 4.1.3 灭活苗的制备 | 第57页 |
| 4.1.4 主要仪器设备 | 第57-58页 |
| 4.1.5 实验猪 | 第58页 |
| 4.1.6 PDCoV S蛋白胞外域的表达纯化 | 第58页 |
| 4.1.7 间接免疫荧光法确定PDCoV IgG阴性血清 | 第58页 |
| 4.1.8 PDCoV IgG及 SIgA ELISA检测方法的建立 | 第58-59页 |
| 4.1.8.1 抗原最佳包被浓度和二抗最佳稀释度的确定 | 第59页 |
| 4.1.8.2 临界值的确定 | 第59页 |
| 4.1.9 中和试验 | 第59页 |
| 4.1.10 PDCoV半数感染量的确定 | 第59页 |
| 4.1.11 PDCoV被动免疫实验设计 | 第59-60页 |
| 4.2 结果 | 第60-74页 |
| 4.2.1 PDCoV S蛋白胞外域的表达纯化 | 第60页 |
| 4.2.2 PDCoV IgG及 SIgA ELISA检测方法的建立 | 第60-62页 |
| 4.2.2.1 PDCoV阴性血清的筛选 | 第60-61页 |
| 4.2.2.2 PDCoV阴性初乳的筛选 | 第61页 |
| 4.2.2.3 IgG ELISA方法抗原最佳包被浓度和最佳二抗稀释度的确定 | 第61-62页 |
| 4.2.2.4 SIgA ELISA方法抗原最佳包被浓度和最佳二抗稀释度的确定 | 第62页 |
| 4.2.2.5 IgG和 SIgA临界值的确定 | 第62页 |
| 4.2.3 PDCoV半数感染量的确定 | 第62-67页 |
| 4.2.3.1 临床症状 | 第62-64页 |
| 4.2.3.2 剖检变化 | 第64页 |
| 4.2.3.3 病理组织变化 | 第64-65页 |
| 4.2.3.4 免疫组化检测病毒抗原分布 | 第65-66页 |
| 4.2.3.5 PDCoV感染后排毒及组织病毒含量 | 第66-67页 |
| 4.2.4 PDCoV灭活苗被动免疫评价 | 第67-73页 |
| 4.2.4.1 免疫程序及分组 | 第67页 |
| 4.2.4.2 攻毒后临床症状 | 第67-68页 |
| 4.2.4.3 剖检变化 | 第68-69页 |
| 4.2.4.4 病理组织变化及抗原检测 | 第69-70页 |
| 4.2.4.5 攻毒后粪便拭子及肠组织病毒含量 | 第70-72页 |
| 4.2.4.6 母猪血清及乳汁中的抗体水平检测 | 第72页 |
| 4.2.4.7 仔猪血清中的抗体水平检测 | 第72-73页 |
| 4.2.5 PDCoV灭活苗被动免疫保护机制 | 第73-74页 |
| 4.3 讨论 | 第74-76页 |
| 第五章 PDCoV灭活苗及活疫苗主动免疫效果评价 | 第76-95页 |
| 5.1 材料和方法 | 第76-79页 |
| 5.1.1 主要实验试剂 | 第76页 |
| 5.1.2 病毒株和细胞 | 第76页 |
| 5.1.3 PDCoV组织毒的制备 | 第76页 |
| 5.1.4 实验动物 | 第76页 |
| 5.1.5 PDCoV口服感染抗体监测实验 | 第76-77页 |
| 5.1.6 PDCoV NH P120 致病性研究 | 第77页 |
| 5.1.7 33日龄断奶猪发病模型的建立 | 第77页 |
| 5.1.8 5日龄仔猪主动免疫及攻毒实验 | 第77-78页 |
| 5.1.9 口服感染或主动免疫后特异性抗体的检测 | 第78页 |
| 5.1.10 中和试验 | 第78页 |
| 5.1.11 细胞因子的检测 | 第78页 |
| 5.1.12 猪外周血PBMC的分离 | 第78-79页 |
| 5.1.13 流式细胞术检测T细胞IFN-γ应答 | 第79页 |
| 5.2 结果 | 第79-93页 |
| 5.2.1 口服感染25 日龄SPF猪的临床症状及抗体检测 | 第79-83页 |
| 5.2.1.1 口服感染后的临床症状 | 第79-80页 |
| 5.2.1.2 荧光定量检测粪便排毒 | 第80-81页 |
| 5.2.1.3 口服感染后的特异性抗体的检测 | 第81-83页 |
| 5.2.2 PDCoV NHP120致病性实验 | 第83-85页 |
| 5.2.2.1 临床症状及剖检变化 | 第83页 |
| 5.2.2.2 病理组织切片观察 | 第83-84页 |
| 5.2.2.3 免疫组织化学观察 | 第84页 |
| 5.2.2.4 粪便拭子及肠组织病毒含量检测 | 第84-85页 |
| 5.2.3 33日龄断奶猪组织毒攻毒实验 | 第85-88页 |
| 5.2.3.1 临床症状及剖检变化 | 第85-86页 |
| 5.2.3.2 病毒载量检测 | 第86-87页 |
| 5.2.3.3 病理组织切片及免疫组化结果 | 第87页 |
| 5.2.3.4 33日龄断奶猪组织毒发病标准 | 第87-88页 |
| 5.2.4 PDCoV 主动免疫实验 | 第88-90页 |
| 5.2.4.1 疫苗免疫后的特异性抗体的检测 | 第88-89页 |
| 5.2.4.2 血清中细胞因子的检测 | 第89页 |
| 5.2.4.3 T细胞IFN-γ应答 | 第89-90页 |
| 5.2.5 主动免疫后的攻毒实验 | 第90-93页 |
| 5.2.5.1 临床症状 | 第90页 |
| 5.2.5.2 剖检变化 | 第90-91页 |
| 5.2.5.3 粪便拭子和组织中的病毒含量 | 第91-92页 |
| 5.2.5.4 病理切片及免疫组化结果 | 第92-93页 |
| 5.3 讨论 | 第93-95页 |
| 第六章 全文结论 | 第95-96页 |
| 参考文献 | 第96-108页 |
| 附录 | 第108-110页 |
| 致谢 | 第110-112页 |
| 作者简历 | 第112页 |
