| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 缩略词表 | 第11-12页 |
| 1 前言 | 第12-22页 |
| 1.1 基因编辑技术的发展历程 | 第12-15页 |
| 1.1.1 锌指核酸酶（ZFNs） | 第13-14页 |
| 1.1.2 转录因子效应物核酸酶（TALEN） | 第14-15页 |
| 1.1.3 CRISPR/Cas9基因定点编辑技术 | 第15页 |
| 1.2 CRISPR/Cas系统的类型及作用原理 | 第15-17页 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas系统的类型 | 第15-16页 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas系统的原理 | 第16-17页 |
| 1.3 CRISPR/Cas9技术在作物遗传改良中的应用 | 第17-18页 |
| 1.4 油菜脂肪酸改良及脂肪酸相关基因的研究进展 | 第18-21页 |
| 1.4.1 FAD2基因的研究进展 | 第19-20页 |
| 1.4.2 FAD3基因的研究进展 | 第20-21页 |
| 1.5 本研究的目的与意义 | 第21-22页 |
| 2 材料和方法 | 第22-31页 |
| 2.1 实验材料 | 第22-23页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第22页 |
| 2.1.2 载体和菌株 | 第22页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第22页 |
| 2.1.4 培养基的配制 | 第22-23页 |
| 2.2 实验方法 | 第23-31页 |
| 2.2.1 FAD2和FAD3基因序列分析 | 第23页 |
| 2.2.2 CRISPR/Cas9载体构建及电击法转化农杆菌GV3101 | 第23-24页 |
| 2.2.3 农杆菌介导的油菜下胚轴遗传转化 | 第24-26页 |
| 2.2.4 转基因植株的阳性及编辑检测 | 第26-27页 |
| 2.2.5 突变单株TA克隆测序验证 | 第27-28页 |
| 2.2.6 突变单株背景回交及不同位点间的杂交聚合 | 第28页 |
| 2.2.7 近红外及GC测定突变体叶片及种子中脂肪酸含量 | 第28-30页 |
| 2.2.8 实验结果整理及数据分析 | 第30-31页 |
| 3 结果分析 | 第31-50页 |
| 3.1 相关靶位点的设计及载体构建 | 第31-35页 |
| 3.1.1 FAD2基因与FAD3基因靶点的选择 | 第31-34页 |
| 3.1.2 CRISPR位点sgRNA的设计和克隆 | 第34-35页 |
| 3.2 油菜遗传转化及转基因阳性苗的鉴定筛选 | 第35-37页 |
| 3.2.1 油菜转基因植株的获得 | 第35-36页 |
| 3.2.2 油菜转基因植株阳性鉴定 | 第36-37页 |
| 3.3 转化当代及后代编辑检测 | 第37-39页 |
| 3.4 突变体的测序分析 | 第39-42页 |
| 3.4.1 FAD2基因突变体的测序分析 | 第39-41页 |
| 3.4.2 FAD3基因突变体的测序分析 | 第41-42页 |
| 3.5 不同靶点突变数量差异分析 | 第42-43页 |
| 3.6 突变单株基因型及回交后代转基因背景清除效率分析 | 第43-46页 |
| 3.6.1 突变单株及自交后代基因型分析 | 第43-45页 |
| 3.6.2 突变单株回交后代中转基因背景清除率的统计 | 第45-46页 |
| 3.7 突变体植株的表型分析 | 第46-48页 |
| 3.7.1 气相色谱仪和近红外测定脂肪酸含量差异比较 | 第46页 |
| 3.7.2 FAD2基因突变单株自交后代油酸含量差异性分析 | 第46-47页 |
| 3.7.3 FAD3基因突变单株T2代种子脂肪酸含量分析 | 第47-48页 |
| 3.8 位点特异标记开发 | 第48-50页 |
| 3.8.1 特异引物设计 | 第48-49页 |
| 3.8.2 位点特异引物PCR效果检测 | 第49-50页 |
| 4 讨论 | 第50-54页 |
| 4.1 CRISPR/Cas9技术突变基因的稳定遗传及在油菜中的初步应用 | 第50页 |
| 4.2 本研究中FAD3基因突变效率低的可能原因 | 第50-51页 |
| 4.3 突变类型及靶位点的突变存在一定的偏好性 | 第51-52页 |
| 4.4 应用CRISPR/Cas9技术在油菜基因功能研究和新种质资源创造中的展望 | 第52-54页 |
| 参考文献 | 第54-62页 |
| 附录1：FAD2与FAD3基因序列比对及标记开发引物设计 | 第62-67页 |
| 附录2：15%非变性PAGE胶试剂配制及检测程序 | 第67-69页 |
| 附录3：FAD2基因T0代突变单株测序结果 | 第69-73页 |
| 附录4：FAD2基因突变单株在T1、T2、T3种子中各种脂肪酸的相对含量 | 第73-75页 |
| 致谢 | 第75页 |
