| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 符号说明 | 第10-12页 |
| 第一章 综述 | 第12-21页 |
| 1. 同源重组介导的基因敲除 | 第13页 |
| 2. 随机插入突变介导的基因敲除 | 第13-14页 |
| 3. RNA干扰介导的基因敲除 | 第14-15页 |
| 4. 锌指核酸酶(ZFNs)介导的基因敲除 | 第15-16页 |
| 5. TALENs介导的基因敲除 | 第16-18页 |
| 6. CRISPR/Cas9介导的基因敲除 | 第18-21页 |
| 6.1 CRISPR/Cas9系统简介 | 第18-19页 |
| 6.2 CRISPR/Cas9系统的分子机制 | 第19-20页 |
| 6.3 CRISPR/Cas9介导的基因敲除的实验流程 | 第20页 |
| 6.4 CRISPR/Cas9介导的基因敲除的优势 | 第20页 |
| 6.5 CRISPR/Cas9介导的基因敲除的问题及展望 | 第20-21页 |
| 第二章 利用CRISPR/Cas9和TALENs技术敲除斑马鱼Vap、C1H7orf55、mri1、BX284640.3和dscr6基因 | 第21-70页 |
| 1. 前言 | 第22-23页 |
| 2. 材料与方法 | 第23-46页 |
| 2.1 实验材料 | 第23-26页 |
| 2.1.1 实验动物 | 第23页 |
| 2.1.2 菌株和质粒 | 第23-24页 |
| 2.1.3 工具酶、试剂和试剂盒 | 第24页 |
| 2.1.4 培养基及其它试剂 | 第24-26页 |
| 2.1.5 实验仪器 | 第26页 |
| 2.2 CRISPR/Cas9介导的Vap、C1H7orf55、mril、BX284640.3基因敲除方法 | 第26-40页 |
| 2.2.1 Cas9靶位点的选择和确认 | 第26-28页 |
| 2.2.2 引物的设计 | 第28-29页 |
| 2.2.3 构建gRNA的体外转录载体 | 第29-33页 |
| 2.2.4 Cas9 mRNA和gRNA的制备 | 第33-37页 |
| 2.2.5 F0突变鱼的制备 | 第37-39页 |
| 2.2.6 F0生殖系的检测 | 第39页 |
| 2.2.7 F1突变鱼的筛选 | 第39-40页 |
| 2.3 TALENs介导的dscr6基因敲除方法 | 第40-46页 |
| 2.3.1 单体的扩增 | 第40页 |
| 2.3.2 TALENs左右臂序列的选择和确认 | 第40-41页 |
| 2.3.3 引物的设计 | 第41-42页 |
| 2.3.4 TALENs左右臂RNA的制备 | 第42-46页 |
| 2.3.5 F0突变鱼的制备 | 第46页 |
| 2.3.6 F0生殖系的检测 | 第46页 |
| 3. 结果与讨论 | 第46-70页 |
| 3.1 CRISPR/Cas9介导的Vap、C1H7orf55、mril、BX284640.3基因的敲除 | 第46-63页 |
| 3.1.1 基因序列的分析和Cas9靶位点的选择 | 第46-52页 |
| 3.1.2 构建gRNA的体外转录载体 | 第52-54页 |
| 3.1.3 Cas9 mRNA和gRNA的制备 | 第54-56页 |
| 3.1.4 F0突变鱼的制备 | 第56-59页 |
| 3.1.5 F0生殖系的检测 | 第59-61页 |
| 3.1.6 F1突变鱼的筛选 | 第61-63页 |
| 3.2 TALENs介导的dscr6基因的敲除 | 第63-70页 |
| 3.2.1 基因序列的分析和TALENs靶位点的选择 | 第63-65页 |
| 3.2.2 构建RNA的体外转录载体 | 第65-66页 |
| 3.2.3 TALENs左右臂RNA的制备 | 第66-67页 |
| 3.2.4 F0突变鱼的制备 | 第67-68页 |
| 3.2.5 F0生殖系的检测 | 第68-70页 |
| 参考文献 | 第70-76页 |
| 致谢 | 第76-77页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第77页 |
