| 中文摘要 | 第7-11页 |
| ABSTRACT | 第11-16页 |
| 第一部分：双功能重组蛋白pLLO-hEGF的设计、表达及对肿瘤的靶向治疗研究 | 第17-60页 |
| 引言 | 第18-21页 |
| 实验材料 | 第21-29页 |
| 实验方法 | 第29-42页 |
| 1 双功能重组蛋白pLLO-hEGF的基因序列设计 | 第29-30页 |
| 2 重组蛋白pLLO-hEGF的生物信息学分析 | 第30页 |
| 3 重组蛋白pLLO-hEGF的原核克隆及表达 | 第30-33页 |
| 4 重组蛋白pLLO-hEGF的亲和层析纯化 | 第33-34页 |
| 5 重组蛋白pLLO-hEGF的内毒素去除 | 第34页 |
| 6 细胞培养 | 第34-35页 |
| 7 细胞总蛋白的提取 | 第35页 |
| 8 蛋白浓度测定BCA法 | 第35页 |
| 9 蛋白质免疫印迹(Western blot) | 第35-37页 |
| 10 细胞增殖实验(MTT法) | 第37-38页 |
| 11 细胞免疫化学荧光染色 | 第38页 |
| 12 人外周血单个核细胞的分离培养(PBMCs) | 第38-39页 |
| 13 淋巴细胞增殖实验 | 第39页 |
| 14 流式细胞术(FCM) | 第39页 |
| 15 淋巴细胞杀伤实验(MTT法) | 第39-40页 |
| 16 体内移植瘤模型实验 | 第40-41页 |
| 17 组织免疫化学染色 | 第41页 |
| 18 统计学方法 | 第41-42页 |
| 实验结果 | 第42-57页 |
| 1 重组原核表达载体pET-30a(+)-pLLO-hEGF的成功构建 | 第42-43页 |
| 1.1 目的基因的PCR扩增和空载质粒双酶切 | 第42页 |
| 1.2 重组质粒pET-30a(+)-pLLO-hEGF的构建和鉴定 | 第42-43页 |
| 2 双功能重组蛋白pLLO-hEGF的诱导表达和纯化 | 第43-45页 |
| 2.1 重组蛋白pLLO-hEGF的成功诱导表达 | 第43-44页 |
| 2.2 重组蛋白pLLO-hEGF的亲和层析纯化 | 第44-45页 |
| 3 重组蛋白pLLO-hEGF的Western blot鉴定 | 第45-46页 |
| 4 重组蛋白pLLO-hEGF的生物信息学分析 | 第46页 |
| 5 高表达EGFR肿瘤细胞系的Western blot筛选 | 第46-47页 |
| 6 重组蛋白pLLO-hEGF对高表达EGFR肿瘤细胞增殖的影响 | 第47-48页 |
| 7 双功能重组蛋白pLLO-hEGF靶向结合高表达EGFR肿瘤细胞的亲和性分析 | 第48-50页 |
| 8 双功能重组蛋白pLLO-hEGF激活淋巴细胞的免疫原性分析 | 第50-51页 |
| 9 双功能重组蛋白pLLO-hEGF活化淋巴细胞可体外杀伤高表达EGFR肿瘤细胞 | 第51-52页 |
| 10 双功能重组蛋白pLLO-hEGF活化人淋巴细胞的体内抗肿瘤作用 | 第52-57页 |
| 10.1 不同组裸小鼠体重变化 | 第52-53页 |
| 10.2 不同组裸小鼠肿瘤生长曲线和瘤重 | 第53页 |
| 10.3 人CD3~+ T淋巴细胞参与裸小鼠外周血循环 | 第53-54页 |
| 10.4 裸小鼠体内肿瘤组织HE染色观察结果 | 第54-56页 |
| 10.5 裸小鼠体内肿瘤组织免疫化学染色观察结果 | 第56-57页 |
| 讨论 | 第57-59页 |
| 小结 | 第59-60页 |
| 第二部分：双功能重组蛋白ScFv-pLLO的设计、表达及抗B细胞淋巴瘤作用研究 | 第60-94页 |
| 引言 | 第61-64页 |
| 实验材料 | 第64-72页 |
| 实验方法 | 第72-83页 |
| 1 双功能重组蛋白ScFv-pLLO的基因序列设计 | 第72-73页 |
| 2 重组蛋白ScFv-pLLO的原核克隆及表达 | 第73-76页 |
| 3 重组蛋白ScFv-pLLO的亲和层析纯化 | 第76页 |
| 4 重组蛋白ScFv-pLLO的内毒素去除 | 第76-77页 |
| 5 细胞培养 | 第77页 |
| 6 细胞总蛋白的提取(悬浮细胞) | 第77-78页 |
| 7 蛋白浓度测定BCA法 | 第78页 |
| 8 蛋白质免疫印迹(Western blot) | 第78-80页 |
| 9 流式细胞术(FCM) | 第80-81页 |
| 10 免疫共沉淀(Co-IP) | 第81页 |
| 11 细胞增殖实验(CCK8法) | 第81-82页 |
| 12 细胞凋亡实验(Annexin V-PI法) | 第82页 |
| 13 统计学方法 | 第82-83页 |
| 实验结果 | 第83-91页 |
| 1 重组原核表达载体pET-30a(+)-ScFv-pLLO的成功构建 | 第83页 |
| 2 双功能重组蛋白ScFv-pLLO的诱导表达、纯化和鉴定 | 第83-86页 |
| 2.1 重组蛋白ScFv-pLLO的成功诱导表达 | 第84页 |
| 2.2 重组蛋白ScFv-pLLO的亲和层析纯化 | 第84-85页 |
| 2.3 重组蛋白ScFv-pLLO的Western blot鉴定 | 第85-86页 |
| 3 双功能重组蛋白ScFv-pLLO靶向结合人淋巴瘤细胞的亲和性分析 | 第86-88页 |
| 3.1 蛋白质免疫印迹法检测不同人淋巴瘤细胞系表面CD20分子的表达水平 | 第86页 |
| 3.2 流式细胞术定量分析不同人淋巴瘤细胞系表面CD20分子表达情况 | 第86-87页 |
| 3.3 流式细胞术定量分析重组蛋白ScFv-pLLO靶向结合人淋巴瘤细胞的能力 | 第87-88页 |
| 3.4 免疫共沉淀分析重组蛋白ScFv-pLLO靶向结合CD20分子的能力 | 第88页 |
| 4 双功能重组蛋白ScFv-pLLO对不同人淋巴瘤细胞系增殖的影响 | 第88-90页 |
| 5 双功能重组蛋白ScFv-pLLO可直接诱导人淋巴瘤细胞Raji凋亡 | 第90-91页 |
| 讨论 | 第91-93页 |
| 小结 | 第93-94页 |
| 第三部分：Leptin在结直肠癌细胞侵袭转移中的作用研究 | 第94-126页 |
| 引言 | 第95-97页 |
| 实验材料 | 第97-103页 |
| 实验方法 | 第103-114页 |
| 1 细胞培养 | 第103页 |
| 2 细胞总蛋白的提取 | 第103页 |
| 3 蛋白浓度测定BCA法 | 第103-104页 |
| 4 逆转录PCR/实时定量PCR(Reverse-transcription PCR/Real Time PCR) | 第104-108页 |
| 5 蛋白质免疫印迹(Western blot) | 第108-110页 |
| 6 小RNA(siRNA)干扰实验(RNAi) | 第110-111页 |
| 7 细胞增殖实验(CCK8法) | 第111页 |
| 8 明胶酶谱实验(MMP9 Zymography) | 第111-112页 |
| 9 体外侵袭实验(Transwell) | 第112-113页 |
| 10 细胞免疫化学染色 | 第113页 |
| 11 统计学方法 | 第113-114页 |
| 实验结果 | 第114-123页 |
| 1 Leptin及其受体LEPR(Ob-R)在人结直肠癌细胞系的表达 | 第114-116页 |
| 1.1 逆转录PCR检测Leptin和LEPR在人结直肠癌细胞系中的表达 | 第114页 |
| 1.2 蛋白质免疫印迹法检测Leptin和LEPR人在结直肠癌细胞系中的表达 | 第114-115页 |
| 1.3 细胞免疫荧光检测Leptin和LEPR在人结直肠癌细胞系中的表达 | 第115-116页 |
| 2 siRNA可有效下调Leptin在人结直肠癌细胞系HCT116/HT-29细胞中的表达 | 第116-117页 |
| 3 siRNA下调Leptin在HCT116/HT-29细胞中的表达对细胞增殖的影响 | 第117-118页 |
| 4 HCT116/HT-29细胞中Leptin RNAi对侵袭转移相关基因表达的影响 | 第118-121页 |
| 4.1 Real-time PCR检测Leptin RNAi后侵袭转移相关基因的表达情况 | 第119-120页 |
| 4.2 Western blot检测Leptin RNAi后侵袭转移相关基因的表达情况 | 第120-121页 |
| 5 敲低HCT116细胞中Leptin的表达可增强MMP9的蛋白裂解活性 | 第121-122页 |
| 6 抑制HCT116细胞中内源性Leptin的表达可增强细胞的侵袭能力 | 第122-123页 |
| 讨论 | 第123-125页 |
| 小结 | 第125-126页 |
| 参考文献 | 第126-133页 |
| 缩略语 | 第133-136页 |
| 文献综述 | 第136-147页 |
| 参考文献 | 第143-147页 |
| 附录：发表文章 | 第147-153页 |
| 致谢 | 第153-154页 |
| 个人简历 | 第154-156页 |
