| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-11页 |
| 前言 | 第12-22页 |
| HSV-1简介 | 第12-13页 |
| HSV-1的基因组结构及编码特点 | 第13页 |
| HSV-1的流行病学分析 | 第13-14页 |
| HSV-1的致病特点和致病机制 | 第14-16页 |
| 原发感染 | 第14-15页 |
| 潜伏感染 | 第15-16页 |
| 复发感染 | 第16页 |
| HSV-1疫苗的研究进展 | 第16-18页 |
| HSV-1重组病毒的构建 | 第18-20页 |
| 温度敏感突变,标记拯救和同源重组技术 | 第18页 |
| 细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)和Red/ET重组系统 | 第18-19页 |
| CRISPR/Cas9系统 | 第19-20页 |
| 实验思路 | 第20-22页 |
| 第一部分 HSV-1突变毒株M1的构建及衣被蛋白UL7在病毒增殖过程中的功能分析 | 第22-66页 |
| 1 材料和方法 | 第22-51页 |
| 1.1 材料 | 第22-30页 |
| 1.1.1 工程菌 | 第22页 |
| 1.1.2 病毒 | 第22页 |
| 1.1.3 细胞系 | 第22页 |
| 1.1.4 实验用动物 | 第22页 |
| 1.1.5 质粒与载体 | 第22-23页 |
| 1.1.6 抗体 | 第23页 |
| 1.1.7 试剂和商品化溶液 | 第23-25页 |
| 1.1.8 引物 | 第25-26页 |
| 1.1.9 主要溶液及配制 | 第26-28页 |
| 1.1.10 主要耗材 | 第28-29页 |
| 1.1.11 主要仪器设备 | 第29-30页 |
| 1.2 方法 | 第30-51页 |
| 1.2.1 细胞培养 | 第30-31页 |
| 1.2.2 病毒培养 | 第31-32页 |
| 1.2.3 质粒构建 | 第32-35页 |
| 1.2.4 质粒提取及质粒转染 | 第35-38页 |
| 1.2.5 HSV-1突变毒株的构建和纯化 | 第38-42页 |
| 1.2.6 突变毒株M1的补偿病毒M1-complemented的制备 | 第42-43页 |
| 1.2.7 突变病毒M1及其补偿病毒在细胞水平的生物学特性分析 | 第43-44页 |
| 1.2.8 突变毒株M1及其补偿病毒在小鼠的致病性分析 | 第44-47页 |
| 1.2.9 HSV-1编码的UL7蛋白对即刻早期基因α-4的转录调控作用分析 | 第47-51页 |
| 1.2.10 统计方法 | 第51页 |
| 2 结果与分析 | 第51-63页 |
| 2.1 HSV-1突变毒株M1的构建 | 第51-53页 |
| 2.1.1 CRISPR/Cas9系统造成HSV-1 u17基因突变的检测 | 第51-52页 |
| 2.1.2 HSV-1突变毒株M1的分离纯化 | 第52-53页 |
| 2.2 突变毒株M1的生物学特性分析 | 第53-54页 |
| 2.2.1 突变毒株M1在Vero细胞上的增殖动力学分析 | 第53-54页 |
| 2.2.2 突变毒株M1在Vero细胞上的蚀斑形态分析 | 第54页 |
| 2.3 突变毒株M1的补偿病毒M1-complemented的生物学特性分析 | 第54-56页 |
| 2.3.1 突变毒株M1的补偿病毒M1-complemented的制备 | 第54-55页 |
| 2.3.2 突变毒株M1的补偿病毒在Vero细胞上的增殖动力学分析 | 第55页 |
| 2.3.3 突变毒株M1的补偿病毒在Vero细胞上的蚀斑形态分析 | 第55-56页 |
| 2.4 突变毒株M1在小鼠的致病性分析 | 第56-61页 |
| 2.4.1 突变病毒M1与补偿病毒感染小鼠后急性发病期临床表现分析 | 第56-57页 |
| 2.4.2 突变毒株M1与补偿病毒感染小鼠后急性发病期组织病理和免疫组织化学分析 | 第57-59页 |
| 2.4.3 突变病毒M1与补偿病毒感染小鼠后急性发病期器官组织中病毒载量分 | 第59-60页 |
| 2.4.4 HSV-1野生型毒株与突变毒株M1感染小鼠后潜伏感染期神经组织中病毒载量和LAT基因的表达水平分析 | 第60-61页 |
| 2.5 HSV-1编码的UL7蛋白在病毒增殖复制中的作用分析 | 第61-63页 |
| 3 讨论 | 第63-66页 |
| 第二部分 HSV-1突变毒株M2和M3的构建及其生物学特性分析 | 第66-81页 |
| 1 材料和方法 | 第66-70页 |
| 1.1 材料 | 第66-68页 |
| 1.1.1 本部分实验所用工程菌、病毒、细胞系、细胞培养用溶液、实验动物、质粒与载体、抗体、商品化试剂和溶液、主要溶液、耗材和设备同第一部分,与第一部分不同的内容如下 | 第66页 |
| 1.1.2 病毒 | 第66页 |
| 1.1.3 细胞系 | 第66页 |
| 1.1.4 试剂和商品化溶液 | 第66页 |
| 1.1.5 引物 | 第66-67页 |
| 1.1.6 原位杂交实验相关溶液配制 | 第67-68页 |
| 1.2 方法 | 第68-70页 |
| 1.2.1 本部分实验所用细胞培养、病毒培养、质粒构建、质粒提取及质粒转染、HSV-1突变毒株的构建和纯化、突变毒株在细胞水平的生物学特性分析和动物水平的致病性分析均同第一部分,与第一部分不同的内容如下 | 第68页 |
| 1.2.2 病毒突变率检测(对得到的P1、P2病毒进行检测) | 第68-69页 |
| 1.2.3 原位杂交 | 第69-70页 |
| 2 结果与分析 | 第70-78页 |
| 2.1 HSV-1突变毒株M2和M3的构建 | 第70-71页 |
| 2.1.1 突变毒株M2和M3中ul7,ul41和LAT基因的修饰突变及鉴定 | 第70-71页 |
| 2.2 突变毒株M1、M2和M3在细胞水平的生物学特性分析 | 第71-73页 |
| 2.3 突变毒株M1、M2和M3在小鼠的致病性分析 | 第73-78页 |
| 2.3.1 突变毒株M1、M2和M3感染小鼠后急性发病期临床表现分析 | 第73-74页 |
| 2.3.2 突变毒株M1、M2和M3感染小鼠后急性发病期组织病理和免疫组织化学分析 | 第74-76页 |
| 2.3.3 突变毒株M1、M2和M3感染小鼠后急性发病期器官组织中的病毒载量分析 | 第76页 |
| 2.3.4 突变毒株M1、M2和M3感染小鼠后潜伏感染期三叉神经节中病毒载量和相关基因表达水平分析 | 第76-77页 |
| 2.3.5 突变毒株M1、M2和M3感染小鼠后潜伏感染期三叉神经节中针对LAT基因的原位杂交分析 | 第77-78页 |
| 3 讨论 | 第78-81页 |
| 第三部分 HSV-1突变毒株M3的免疫原性分析 | 第81-99页 |
| 1 材料和方法 | 第81-85页 |
| 1.1 材料 | 第81-82页 |
| 1.1.1 本部分实验所用病毒、细胞系、细胞培养用溶液、实验动物、抗体、商品化试剂和溶液、主要溶液、耗材和设备同第一部分,与第一部分不同的内容如下 | 第81页 |
| 1.1.2 病毒 | 第81页 |
| 1.1.3 试剂和商品化溶液 | 第81页 |
| 1.1.4 引物及肽段 | 第81-82页 |
| 1.2 方法 | 第82-85页 |
| 1.2.1 本部分实验所用细胞培养、病毒培养、病毒感染后动物水平的致病性分析均同第一部分,与第一部分不同的内容如下 | 第82页 |
| 1.2.2 动物免疫 | 第82页 |
| 1.2.3 小鼠免疫血清制备 | 第82页 |
| 1.2.4 小鼠脾淋巴细胞的分离 | 第82-83页 |
| 1.2.5 抗血清中和实验 | 第83-84页 |
| 1.2.6 IFN-γ Elispot检测 | 第84-85页 |
| 2 结果与分析 | 第85-96页 |
| 2.1 HSV-1突变毒株M3的免疫原性分析 | 第85-96页 |
| 2.1.1 突变毒株M3在小鼠体内诱导的免疫反应分析 | 第85-86页 |
| 2.1.2 突变毒株M3在小鼠体内的免疫保护效率分析 | 第86-96页 |
| 3 讨论 | 第96-99页 |
| 总结 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-111页 |
| 论文综述 基因编辑技术在衣被蛋白研究中的意义 | 第111-126页 |
| 引言 | 第112-113页 |
| 衣被蛋白研究的早期 | 第113-114页 |
| 衣被蛋白研究的发展阶段 | 第114-117页 |
| 病毒基因转录调控因子 | 第114-115页 |
| 病毒基因组复制相关蛋白-UTPase | 第115页 |
| 胸苷激酶TK | 第115-116页 |
| 病毒毒力相关蛋白 | 第116页 |
| 病毒转运及成熟相关蛋白 | 第116-117页 |
| 衣被蛋白研究的崭新阶段 | 第117-118页 |
| 结论 | 第118-119页 |
| 参考文献 | 第119-126页 |
| 附录 | 第126-129页 |
| 附录1 论文中突变毒株的基因片段 | 第126-129页 |
| 缩略词表 | 第129-131页 |
| 致谢 | 第131-132页 |
| 研究生个人简历 | 第132-133页 |
