| 摘要 | 第1-11页 |
| ABSTRACT | 第11-14页 |
| 符号说明 | 第14-16页 |
| 第一章 绪论 | 第16-34页 |
| ·半纤维素酶 | 第17-26页 |
| ·木聚糖酶(XYN)概述 | 第18-20页 |
| ·阿拉伯呋喃糖苷酶(AF)概述 | 第20-22页 |
| ·乙酰木聚糖酯酶(AXE)概述 | 第22-23页 |
| ·阿魏酸酯酶(FAE)概述 | 第23-25页 |
| ·甘露聚糖酶(MAN)概述 | 第25-26页 |
| ·木质纤维素降解酶基因的表达 | 第26-29页 |
| ·原核生物表达系统 | 第27页 |
| ·酵母表达系统 | 第27-28页 |
| ·高等生物细胞表达系统 | 第28-29页 |
| ·丝状真菌表达系统 | 第29页 |
| ·RNA干扰技术 | 第29-32页 |
| ·RNAi的发现 | 第30页 |
| ·RNAi的原理 | 第30-31页 |
| ·RNA干扰发生策略 | 第31页 |
| ·RNAi在丝状真菌中的应用 | 第31-32页 |
| ·本论文的立题依据和研究内容 | 第32-34页 |
| 第二章 草酸青霉本源半纤维素酶的筛选 | 第34-50页 |
| 引言 | 第34-35页 |
| ·实验材料与方法 | 第35-42页 |
| ·菌株与质粒 | 第35页 |
| ·培养基与培养条件 | 第35-36页 |
| ·培养基 | 第35页 |
| ·草酸青霉培养条件 | 第35-36页 |
| ·主要储备液配制 | 第36页 |
| ·常用缓冲液 | 第36页 |
| ·转化及培养所需溶液 | 第36页 |
| ·基因组提取所需试剂 | 第36页 |
| ·糖化及测定溶液 | 第36页 |
| ·主要试剂与仪器 | 第36-37页 |
| ·引物序列 | 第37-38页 |
| ·实验方法 | 第38-42页 |
| ·草酸青霉114-2基因组提取 | 第38页 |
| ·目的基因扩增及表达盒构建 | 第38-39页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳分析及PCR产物回收 | 第39页 |
| ·草酸青霉原生质体的制备与转化 | 第39-40页 |
| ·转化子分纯传代 | 第40-41页 |
| ·转化子的PCR验证 | 第41页 |
| ·转化子产酶发酵 | 第41页 |
| ·发酵液蛋白含量测定及SDS-PAGE | 第41页 |
| ·发酵液糖化能力测定 | 第41页 |
| ·蛋白序列分析 | 第41-42页 |
| ·结果与讨论 | 第42-49页 |
| ·目的蛋白序列分析 | 第42-43页 |
| ·目的蛋白表达盒的构建 | 第43-45页 |
| ·目的蛋白在草酸青霉A15A中的表达及验证 | 第45-46页 |
| ·半纤维素酶过表达菌株的PCR验证 | 第45-46页 |
| ·半纤维素酶过表达菌株发酵液的SDS-PAGE分析 | 第46页 |
| ·含过表达半纤维素的重组纤维素酶系的糖化能力 | 第46-49页 |
| ·本章小结 | 第49-50页 |
| 第三章 半纤维素酶表达纯化及酶学性质和应用潜能探究 | 第50-66页 |
| 引言 | 第50页 |
| ·实验材料与方法 | 第50-57页 |
| ·菌株与质粒 | 第50-51页 |
| ·培养基与培养条件 | 第51页 |
| ·主要储备液配制 | 第51-52页 |
| ·常用缓冲液 | 第51页 |
| ·转化及培养所需溶液 | 第51-52页 |
| ·主要试剂与仪器 | 第52页 |
| ·引物序列 | 第52-53页 |
| ·实验方法 | 第53-57页 |
| ·目的基因克隆与纯化 | 第53页 |
| ·半纤维素酶表达载体构建 | 第53-54页 |
| ·大肠杆菌转化及转化子验证 | 第54-55页 |
| ·草酸青霉A11△原生质体转化及转化子分纯 | 第55页 |
| ·转化子产酶发酵 | 第55页 |
| ·发酵液蛋白量测定及SDS-PAGE分析 | 第55页 |
| ·蛋白的分离纯化 | 第55-56页 |
| ·酶的底物特异性分析 | 第56页 |
| ·温度和pH对酶活力的影响 | 第56-57页 |
| ·糖化实验半纤维素酶的添加办法 | 第57页 |
| ·结果与讨论 | 第57-64页 |
| ·半纤维素酶表达载体构建 | 第57-58页 |
| ·半纤维素酶的本源表达及纯化 | 第58页 |
| ·本源表达的半纤维素酶的蛋白含量测定 | 第58-60页 |
| ·温度和pH对酶活影响 | 第60-62页 |
| ·半纤维素酶的添加对赛诺纤维素酶的糖化能力的影响 | 第62-64页 |
| ·半纤维素酶的添加对里氏木霉QM9414发酵液的糖化能力的影响 | 第64页 |
| ·本章小结 | 第64-66页 |
| 第四章 应用于丝状真菌的高效RNA干扰系统建立 | 第66-80页 |
| 引言 | 第66-67页 |
| ·实验材料与方法 | 第67-72页 |
| ·菌株与质粒 | 第67页 |
| ·培养基与培养条件 | 第67页 |
| ·主要储备液配制 | 第67页 |
| ·主要试剂与仪器 | 第67页 |
| ·引物设计及合成 | 第67-69页 |
| ·实验方法 | 第69-72页 |
| ·片段扩增 | 第69页 |
| ·表达质粒K-hph-PpgmC的构建 | 第69-70页 |
| ·通用干扰质粒pHX-RNAi构建 | 第70页 |
| ·单基因干扰载体pHX-amyi和双基因干扰载体pHX-iac的构建 | 第70-71页 |
| ·草酸青霉干扰菌株Amy15Ai和114-iac构建 | 第71页 |
| ·淀粉酶活和纤维素外切酶活测定 | 第71页 |
| ·SDS-PAGE验证干扰菌株的干扰效果 | 第71-72页 |
| ·RT-qPCR检测干扰菌株amy15A和cel7A-2的mRNA | 第72页 |
| ·结果与讨论 | 第72-79页 |
| ·干扰质粒pHX-RNAi构建和鉴定 | 第72-73页 |
| ·amy15A干扰载体和amy15A/cel7A-2双基因干扰载体构建 | 第73-74页 |
| ·amy15A干扰菌株和amy15A/cel7A-2双基因干扰菌株构建 | 第74页 |
| ·草酸青霉amyl5A单基因干扰效果分析 | 第74-76页 |
| ·Amy15Ai菌株胞外蛋白分泌情况 | 第74-75页 |
| ·Amy15Ai菌株amy15A的mRNA分析 | 第75-76页 |
| ·草酸青霉amy15A/cel7A-2双基因干扰效果分析 | 第76-79页 |
| ·双基因干扰菌株114-iac的酶活测定 | 第76-77页 |
| ·114-iac菌株的胞外蛋白分泌情况 | 第77页 |
| ·114-iac中amy15A和cel7A-2 mRNA分析 | 第77-79页 |
| ·本章小结 | 第79-80页 |
| 论文创新性结果总结与展望 | 第80-82页 |
| 参考文献 | 第82-89页 |
| 攻读学位期间已(待)发表的学术论文 | 第89-90页 |
| 致谢 | 第90-92页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第92页 |
