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水稻黑条矮缩病毒编码蛋白P7-2与寄主水稻蛋白互作研究

中文摘要第1-7页
Abstract第7-13页
文献综述第13-19页
 1 水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)的生物学特点第13-16页
   ·RBSDV的发生及危害第13页
   ·RBSDV的症状及传播介体第13页
   ·RBSDV的分类地位第13-15页
   ·RBSDV粒子第15-16页
 2 水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)分子生物学特点第16-17页
 3 蛋白质互作技术及Pull-Down原理简介第17-18页
 4 实时荧光定量PCR在检测植物基因表达中的应用第18-19页
引言第19-21页
材料与方法第21-36页
 1 供试材料第21-22页
   ·病样来源第21页
   ·植物材料第21页
   ·载体及菌株第21页
   ·酶和化学试剂第21页
   ·仪器设备第21-22页
 2 实验方法第22-36页
   ·引物的设计与合成第22页
   ·RBSDVP7-2基因的克隆第22-26页
     ·Trizol法提取总RNA第22页
     ·RT-PCR第22-23页
     ·PCR产物的纯化第23页
     ·连接反应第23-24页
     ·大肠杆菌感受态细胞的制备第24页
     ·重组质粒的热激转化第24页
     ·菌落PCR初步鉴定阳性克隆第24-25页
     ·重组质粒的小量提取第25页
     ·重组质粒的双酶切鉴定第25页
     ·序列测定和分析第25-26页
   ·P7-2的原核表达及抗血清制备第26-28页
     ·原核表达质粒构建第26页
     ·目的蛋白小量诱导表达第26页
     ·SDS-PAGE检测第26-27页
     ·目的蛋白大量表达和包涵体的提取第27页
     ·目的蛋白的透析纯化与回收第27页
     ·抗血清制备及检测第27-28页
   ·P7-2融合蛋白与水稻总蛋白Pull-Down第28-29页
     ·MBP-P7-2融合蛋白及MBP蛋白的大量诱导表达第28页
     ·粗提感病水稻叶片总蛋白第28-29页
     ·目的蛋白与水稻总蛋白Pull-Down第29页
     ·对照蛋白与水稻总蛋白Pull-Down第29页
     ·SDS-PAGE检测第29页
     ·蛋白质序列的测定及质谱分析第29页
   ·寄主水稻互作因子基因表达的定量分析第29-32页
     ·水稻总RNA的提取第29-30页
     ·逆转录第30-31页
     ·引物的设计与合成第31页
     ·SqRT-PCR与qRT-PCR第31-32页
   ·P7-2在植物细胞中的亚细胞定位第32-36页
     ·引物的设计与合成第32页
     ·PCR扩增S7-220第32页
     ·PCR产物的纯化第32页
     ·连接反应第32页
     ·重组质粒的热激转化第32页
     ·菌落PCR初步鉴定阳性克隆第32页
     ·重组质粒的小量提取第32页
     ·重组质粒的酶切鉴定及序列测定第32-33页
     ·表达质粒构建第33页
     ·日本晴悬浮细胞体系的建立第33-34页
     ·拟南芥Col-0品种无菌苗培育第34页
     ·去除细胞壁获得原生质体第34页
     ·原生质体的纯化第34页
     ·重组质粒的原生质体转化第34-35页
     ·共聚焦显微镜观察第35-36页
结果与分析第36-47页
 1 RBSDVP7-2的基因克隆及序列分析第36-37页
   ·RBSDV基因组片段S7-2的扩增第36页
   ·扩增产物的克隆和序列分析第36-37页
 2 P7-2的原核表达及抗血清制备第37-40页
   ·原核表达质粒的构建第37-38页
   ·P7-2的原核表达及包涵体的提取第38页
   ·目的蛋白的纯化与回收第38-39页
   ·Westernblot检测抗血清效价第39-40页
 3 P7-2与寄主水稻蛋白的互作分析第40-42页
   ·pMAL-P7-2与pMAL-C2x的大量诱导表达第40页
   ·Pull-Down后SDS-PAGE检测第40页
   ·序列测定及质谱分析确定寄主互作因子第40-42页
 4 寄主水稻互作因子基因表达的定量分析第42-43页
   ·RT-PCR调整cDNA浓度第42页
   ·SqRT-PCR第42页
   ·水稻基因表达的定量分析第42-43页
 5 P7-2在植物细胞中的亚细胞定位第43-47页
   ·S7-2基因的克隆第43-44页
   ·重组表达质粒的构建第44页
   ·拟南芥原生质体中的荧光定位第44-45页
   ·水稻原生质体细胞中GFP基因的表达第45-47页
讨论第47-52页
 1 RBSDVP7-2的基因克隆及序列分析第47页
 2 RBSDVP7-2的原核表达及抗血清制备第47-48页
 3 P7-2融合蛋白与寄主水稻总蛋白的互作分析第48-49页
 4 寄主互作因子基因表达的定量分析第49-50页
 5 P7-2在植物细胞中的亚细胞定位第50-52页
全文总结及展望第52-53页
参考文献第53-57页
附录A:常用溶液及培养基配制方法第57-59页
致谢第59-60页
作者简介第60页
在读期间发表的学术论文第60页

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