| 目录 | 第1-8页 |
| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 第1章 文献综述 | 第12-28页 |
| ·昆虫危害概述 | 第12页 |
| ·虫生真菌绿僵菌概述 | 第12-17页 |
| ·绿僵菌属的系统分类现状 | 第12-13页 |
| ·绿僵菌的生物学特性 | 第13页 |
| ·绿僵菌侵染寄主机理 | 第13-16页 |
| ·绿僵菌应用现状 | 第16-17页 |
| ·磷酸酶概述 | 第17-23页 |
| ·磷酸酶的分类 | 第17-19页 |
| ·磷酸酶的作用 | 第19-22页 |
| ·磷酸酶在病原菌侵染寄主中的地位与作用 | 第22-23页 |
| ·外源蛋白表达系统巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第23-28页 |
| ·P. Pastoris表达系统的优点 | 第23-24页 |
| ·P. Pastoris表达系统胞内及分泌表达外源蛋白 | 第24页 |
| ·P. Pastoris转化子筛选 | 第24-25页 |
| ·影响外源蛋白在P. Pastoris中表达的因素 | 第25-28页 |
| 第2章 绪论 | 第28-32页 |
| ·研究目的和意义 | 第28-29页 |
| ·研究内容及技术路线 | 第29页 |
| ·研究内容 | 第29页 |
| ·研究技术路线 | 第29页 |
| ·研究特色与创新点 | 第29-32页 |
| 第3章 试验方案 | 第32-50页 |
| ·试验材料 | 第32-37页 |
| ·试验菌株 | 第32页 |
| ·感受态细胞 | 第32页 |
| ·载体 | 第32页 |
| ·主要试剂和溶液配制 | 第32-34页 |
| ·主要试剂和试剂盒 | 第34-35页 |
| ·基本培养基 | 第35-36页 |
| ·试验用酶和引物 | 第36-37页 |
| ·主要仪器设备 | 第37页 |
| ·试验方法 | 第37-48页 |
| ·克隆绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶基因 | 第37-42页 |
| ·构建绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶体外表达系统——巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第42-45页 |
| ·高效表达目的蛋白菌株筛选 | 第45-47页 |
| ·目的蛋白表达诱导甲醇浓度优化 | 第47页 |
| ·诱导目标蛋白大量表达 | 第47页 |
| ·分析绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶酶特性 | 第47-48页 |
| ·数据的统计分析 | 第48-50页 |
| 第4章 结果与分析 | 第50-72页 |
| ·克隆绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶基因 | 第50-54页 |
| ·克隆目的基因 | 第50-51页 |
| ·目的基因检测 | 第51-54页 |
| ·构建绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶表达载体 | 第54-58页 |
| ·Eco Ⅰ切含目的基因重组质粒pEASY-ptp和蛋白表达载体pPIC9K | 第55-56页 |
| ·目的基因亚克隆进毕赤酵母表达载体pPIC9K构建pPIC9K-ptp | 第56-58页 |
| ·毕赤酵母表达载体电转化毕赤酵母KM71感受态细胞构建毕赤酵母重组子9k-PTPase | 第58-61页 |
| ·Sac Ⅰ线性化表达载体pPIC9K-ptp和pPIC9K | 第58-59页 |
| ·Linear pPIC9K-ptp和Linear pPIC9K电转化感受态KM71 | 第59页 |
| ·筛选遗传霉素抗性转化子 | 第59-60页 |
| ·PCR检测表达载体在毕赤酵母中整合情况 | 第60-61页 |
| ·诱导重组毕赤酵母9k-PTPase表达目标蛋白 | 第61-64页 |
| ·SDS-PAGE分析检测蛋白表达情况 | 第61-62页 |
| ·蛋白印迹(western blotting)分析检测目标蛋白表达情况 | 第62页 |
| ·P.pichia表达菌株表达条件优化 | 第62-64页 |
| ·绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶特性分析 | 第64-72页 |
| ·镍柱亲和纯化目标蛋白 | 第64页 |
| ·聚丙烯酰胺等点聚焦电泳(IEF-PAGE)及磷酸酶pI测定 | 第64-65页 |
| ·酶的纯度鉴定 | 第65页 |
| ·酶最适作用温度分析 | 第65-66页 |
| ·酶最适作用pH分析 | 第66-67页 |
| ·酶底物特异性分析 | 第67页 |
| ·磷酸酶抑制剂对酶活性的影响 | 第67-68页 |
| ·金属离子对酶活性的影响 | 第68-72页 |
| 第5章 结论与讨论 | 第72-74页 |
| ·目的基因克隆 | 第72页 |
| ·磷酸酶类型的确定 | 第72-74页 |
| 参考文献 | 第74-82页 |
| 致谢 | 第82-84页 |
| 附录 | 第84-90页 |
| 发表论文及参加课题 | 第90页 |
