| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 目录 | 第6-9页 |
| 第一章 前言 | 第9-21页 |
| 1 重叠PCR技术的研究进展 | 第9-12页 |
| ·重叠PCR技术的建立 | 第9页 |
| ·重叠PCR技术的原理 | 第9页 |
| ·重叠延伸PCR技术的特点 | 第9-10页 |
| ·重叠PCR技术的应用 | 第10-11页 |
| ·重叠PCR克隆融合基因 | 第10-11页 |
| ·重叠PCR克隆突变基因 | 第11页 |
| ·重叠PCR用于基因敲除 | 第11页 |
| ·重叠PCR扩增目的基因 | 第11页 |
| ·展望 | 第11-12页 |
| 2 洛伐他汀的研究进展 | 第12-19页 |
| ·洛伐他汀的发现 | 第12页 |
| ·洛伐他汀的结构和理化性质 | 第12-13页 |
| ·洛伐他汀的活性机理和药用价值 | 第13-16页 |
| ·洛伐他汀的活性机理 | 第13-14页 |
| ·洛伐他汀的调脂作用 | 第14-15页 |
| ·洛伐他汀的非调脂作用 | 第15-16页 |
| ·洛伐他汀生物合成酶 | 第16页 |
| ·洛伐他汀生物合成机理 | 第16-18页 |
| ·洛伐他汀生产工艺研究现状 | 第18页 |
| ·他汀类药物的市场前景 | 第18页 |
| ·他汀类药物展望 | 第18-19页 |
| 3 本研究的目的和意义 | 第19-20页 |
| 4 本研究的技术路线 | 第20-21页 |
| 第二章 材料和方法 | 第21-29页 |
| 1 实验材料 | 第21-22页 |
| ·主要仪器 | 第21页 |
| ·菌株 | 第21页 |
| ·主要试剂 | 第21-22页 |
| ·培养基及实验试剂配制 | 第22页 |
| ·LB固体培养基 | 第22页 |
| ·Czapek's液体培养基 | 第22页 |
| ·土曲霉DNA提取相关试剂 | 第22页 |
| 2 实验方法 | 第22-29页 |
| ·模板的制备 | 第22-23页 |
| ·土曲霉菌体的培养 | 第22页 |
| ·材料处理和粗提 | 第22-23页 |
| ·纯化 | 第23页 |
| ·电泳分析 | 第23页 |
| ·LOVB基因引物设计 | 第23-24页 |
| ·目的DNA片段的获得 | 第24-26页 |
| ·重叠PCR扩增 | 第24-25页 |
| ·重叠PCR扩增影响因素的比较 | 第25-26页 |
| ·目的DNA片段和T克隆载体的连接 | 第26页 |
| ·氯化钙法制备大肠杆菌DH5a感受态细胞 | 第26页 |
| ·大肠杆菌DH5a的转化 | 第26-27页 |
| ·转化子的检测和鉴定 | 第27-29页 |
| ·PCR快速筛选 | 第27-28页 |
| ·重组质粒的测序 | 第28-29页 |
| 第三章 实验结果 | 第29-37页 |
| 1 土曲霉总DNA的提取 | 第29页 |
| 2 目的基因的PCR扩增结果 | 第29-34页 |
| ·第一轮PCR的扩增结果 | 第29页 |
| ·第二轮PCR的扩增结果 | 第29-31页 |
| ·第三轮PCR的扩增结果 | 第31页 |
| ·重叠PCR扩增影响因素的比较结果 | 第31-34页 |
| ·不同退火温度和Mg~(2+)浓度的比较结果 | 第31-32页 |
| ·三段或两段DNA片段拼接的比较结果 | 第32-33页 |
| ·直接和间接模板应用的比较结果 | 第33页 |
| ·模板纯化和不纯化的比较 | 第33-34页 |
| 3 重组质粒的菌落PCR鉴定结果 | 第34-35页 |
| 4 重组质粒的序列测定结果 | 第35-37页 |
| 第四章 讨论 | 第37-40页 |
| 1 重叠延伸PCR克隆洛伐他汀九酮合成酶基因LOVB①-④的cDNA序列 | 第37页 |
| 2 重叠引物的设计 | 第37页 |
| 3 重叠延伸反应条件 | 第37-38页 |
| 4 DNA聚合酶的选择 | 第38页 |
| 5 PCR产物的纯化回收 | 第38-39页 |
| 6 本实验需进一步完善的地方 | 第39-40页 |
| 第五章 小结 | 第40-41页 |
| 参考文献 | 第41-45页 |
| 附录一 培养基和试剂配方 | 第45-47页 |
| 附录二 琼脂糖凝胶回收步骤 | 第47-48页 |
| 附录三 质粒的小量提取 | 第48-49页 |
| 附录四 重组质粒的测序结果 | 第49-59页 |
| 致谢 | 第59页 |