| 摘要 | 第1-4页 |
| ABSTRACT | 第4-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-22页 |
| ·概述 | 第11页 |
| ·钠尿肽家族研究进展 | 第11-15页 |
| ·钠尿肽家族（natriuretic peptides, NPs）成员 | 第11-13页 |
| ·钠尿肽受体（natriuretic peptide receptor, NPR） | 第13-15页 |
| ·BNP 研究进展 | 第15-20页 |
| ·BNP 的生理功能 | 第15-16页 |
| ·BNP 的临床应用 | 第16页 |
| ·rhBNP 药物目前存在的问题与解决措施 | 第16-19页 |
| ·人血清白蛋白（HSA）融合技术研究进展 | 第19-20页 |
| ·立题背景及研究内容 | 第20-22页 |
| 第二章 RHBNP 新药物分子设计与其表达载体的构建 | 第22-32页 |
| ·材料 | 第22-24页 |
| ·菌种和质粒 | 第22页 |
| ·培养基 | 第22-23页 |
| ·工具酶 | 第23页 |
| ·试剂 | 第23页 |
| ·主要仪器 | 第23页 |
| ·引物 | 第23-24页 |
| ·(bnp)_2 基因的优化与合成 | 第24页 |
| ·方法 | 第24-28页 |
| ·重组质粒pMD19T-hsa 的构建 | 第24-26页 |
| ·融合基因hsa-(bnp)_2 的拼接 | 第26-27页 |
| ·融合基因bnp-hsa 的拼接 | 第27页 |
| ·融合基因(bnp)_2-hsa 的拼接 | 第27页 |
| ·融合基因(bnp)_4-hsa 的拼接 | 第27-28页 |
| ·融合基因与表达载体pPIC9K 的连接 | 第28页 |
| ·结果与讨论 | 第28-31页 |
| ·融合基因hsa-(bnp)2、bnp-hsa、(bnp)2-hsa 和(bnp)4-hsa 的构建原理 | 第28-30页 |
| ·PCR 扩增hsa 和bnp 目的基因 | 第30页 |
| ·构建表达载体pPIC9K-hsa-(bnp)_2、pPIC9K-bnp-hsa、pPIC9K-(bnp)_2-hsa 和pPIC9K-(bnp)_4-hsa | 第30-31页 |
| ·本章小结 | 第31-32页 |
| 第三章 RHBNP 新药物分子制备的摇瓶发酵条件研究 | 第32-42页 |
| ·材料 | 第32-33页 |
| ·菌种 | 第32页 |
| ·培养基 | 第32-33页 |
| ·试剂 | 第33页 |
| ·主要仪器 | 第33页 |
| ·方法 | 第33-36页 |
| ·线性化表达载体的制备 | 第33页 |
| ·毕赤酵母GS115 感受态细胞的制备 | 第33-34页 |
| ·毕赤酵母GS115 感受态细胞的转化 | 第34页 |
| ·融合蛋白的诱导表达 | 第34-35页 |
| ·发酵液中融合蛋白的western blot 鉴定 | 第35页 |
| ·毕赤酵母工程菌生长曲线的测定 | 第35页 |
| ·甲醇浓度和诱导时间对融合蛋白表达的影响 | 第35页 |
| ·扩大培养时不同浓缩倍数对融合蛋白表达的影响 | 第35-36页 |
| ·结果与讨论 | 第36-41页 |
| ·融合蛋白的诱导表达及高产菌株的筛选 | 第36-37页 |
| ·发酵液中融合蛋白的western blot 鉴定 | 第37页 |
| ·生长曲线测定 | 第37-38页 |
| ·甲醇浓度和诱导时间对融合蛋白表达的影响 | 第38-40页 |
| ·扩大培养时不同浓缩倍数对融合蛋白表达的影响 | 第40-41页 |
| ·本章小结 | 第41-42页 |
| 第四章 RHBNP 新药物分子的分离纯化研究 | 第42-53页 |
| ·材料 | 第42-43页 |
| ·菌种 | 第42页 |
| ·培养基及溶液配制 | 第42-43页 |
| ·试剂 | 第43页 |
| ·主要仪器 | 第43页 |
| ·方法 | 第43-45页 |
| ·毕赤酵母工程菌在7.5 l 发酵罐中的高密度发酵实验 | 第43-44页 |
| ·发酵液的超滤浓缩 | 第44页 |
| ·HSA-(BNP)_2 发酵液的初步分离纯化 | 第44-45页 |
| ·BNP-HSA、(BNP)_2-HSA 和(BNP)_4-HSA 发酵液的初步分离纯化 | 第45页 |
| ·融合蛋白的精细纯化 | 第45页 |
| ·HPLC 检测融合蛋白纯度 | 第45页 |
| ·结果与讨论 | 第45-52页 |
| ·毕赤酵母工程菌在发酵罐中的高密度发酵实验 | 第45-46页 |
| ·发酵液的超滤浓缩 | 第46-47页 |
| ·HSA-(BNP)_2 发酵液的初步分离纯化 | 第47-49页 |
| ·BNP-HSA、(BNP)_2-HSA 和(BNP)_4-HSA 发酵液的初步分离纯化 | 第49-51页 |
| ·融合蛋白的精细纯化 | 第51页 |
| ·HPLC 检测融合蛋白纯度 | 第51-52页 |
| ·本章小结 | 第52-53页 |
| 第五章 RHBNP 新药物分子的活性分析 | 第53-63页 |
| ·材料 | 第53-54页 |
| ·细胞株与样品 | 第53页 |
| ·培养基与试剂 | 第53-54页 |
| ·主要溶液配制 | 第54页 |
| ·实验动物 | 第54页 |
| ·主要仪器 | 第54页 |
| ·方法 | 第54-58页 |
| ·rhBNP 细胞活性分析 | 第54-57页 |
| ·大鼠体内降压活性实验 | 第57-58页 |
| ·结果与讨论 | 第58-62页 |
| ·rhBNP 细胞活性分析 | 第58-61页 |
| ·融合蛋白体内活性验证 | 第61-62页 |
| ·本章小结 | 第62-63页 |
| 第六章 RHBNP 新药物分子定量分析及其初步应用 | 第63-72页 |
| ·材料 | 第63-64页 |
| ·主要试剂 | 第63页 |
| ·主要仪器 | 第63-64页 |
| ·实验动物 | 第64页 |
| ·主要溶液配方 | 第64页 |
| ·方法 | 第64-66页 |
| ·融合蛋白HSA-(BNP)_2 标准品浓度系列准备 | 第64页 |
| ·双抗夹心ELISA 基本操作步骤 | 第64-65页 |
| ·捕获抗体和检测抗体最佳稀释倍数的确定 | 第65页 |
| ·标准曲线的绘制 | 第65页 |
| ·方法学评价 | 第65-66页 |
| ·小鼠初步药代动力学分析 | 第66页 |
| ·结果 | 第66-70页 |
| ·捕获抗体和检测抗体最佳稀释倍数的确定 | 第66-67页 |
| ·标准曲线绘制 | 第67页 |
| ·方法学评价 | 第67-69页 |
| ·小鼠初步药代动力学分析 | 第69-70页 |
| ·讨论 | 第70-71页 |
| ·本章小结 | 第71-72页 |
| 结论与展望 | 第72-74页 |
| 创新点 | 第74-75页 |
| 致谢 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-84页 |
| 附录Ⅰ：作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第84-85页 |
| 附录Ⅱ：融合基因DNA 序列 | 第85-88页 |
