| 摘要 | 第1-12页 |
| ABSTRACT | 第12-16页 |
| 符号说明及缩略词 | 第16-17页 |
| 第一节 综述 | 第17-43页 |
| ·纤维素酶 | 第18-24页 |
| ·糖苷水解酶家族和纤维素酶命名法 | 第18-20页 |
| ·纤维素酶系的组成 | 第20-21页 |
| ·纤维素酶的酶学性质 | 第21-24页 |
| ·纤维素酶异源表达的研究进展 | 第24-30页 |
| ·在酵母中表达的纤维素酶 | 第24-28页 |
| ·在细菌中表达的纤维素酶 | 第28-29页 |
| ·丝状真菌中表达的纤维素酶 | 第29-30页 |
| ·纤维素酶蛋白质工程的研究进展 | 第30-41页 |
| ·蛋白质工程的研究手段和方法 | 第31-34页 |
| ·蛋白质工程在纤维素酶蛋白改造上的应用 | 第34-41页 |
| ·本研究的目的与主要工作内容 | 第41-43页 |
| 第二节 重组瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅱ的糖基化分析 | 第43-61页 |
| ·材料和方法 | 第44-49页 |
| ·菌株和质粒 | 第44页 |
| ·培养基和培养方法 | 第44-45页 |
| ·试剂,工具酶与仪器 | 第45页 |
| ·来源于酿酒酵母H158的rEGⅡ的分离纯化 | 第45-46页 |
| ·来源于瑞氏木霉QM9414的native-EGⅡ的分离纯化 | 第46页 |
| ·蛋白质电泳和活性染色 | 第46-47页 |
| ·重组EGⅡ分子量的确定 | 第47页 |
| ·重组EGⅡ的去糖基化 | 第47页 |
| ·内切葡聚糖酶活性测定 | 第47-48页 |
| ·pH对酶活力的影响 | 第48页 |
| ·酶耐温性 | 第48页 |
| ·重组EGⅡ和native-EGⅡ对不同纤维素多聚物的降解能力的测定 | 第48-49页 |
| ·结果与分析 | 第49-57页 |
| ·SC培养基中表达有rEGⅡ的酿酒酵母的生长及rEGⅡ的合成情况 | 第49页 |
| ·来源于瑞氏木霉的野生型内切葡聚糖酶Ⅱ(native-EGⅡ)的纯化 | 第49-51页 |
| ·来源于酿酒酵母的重组内切葡聚糖酶Ⅱ(rEGⅡ)的分离纯化 | 第51-52页 |
| ·rEGⅡ蛋白的异质性和其去糖基化后的性质分析 | 第52-53页 |
| ·重组EGⅡ和native-EGⅡ对不同纤维素多聚物的降解能力 | 第53-54页 |
| ·pH对重组EGⅡ和native EGⅡ酶活力的影响 | 第54-55页 |
| ·温度对重组EGⅡ和native EGⅡ酶活力的影响 | 第55-56页 |
| ·培养基成分对重组EGⅡ糖基化程度和酶活力的影响 | 第56-57页 |
| ·讨论 | 第57-59页 |
| ·糖基化对重组EGⅡ性质的影响 | 第57-58页 |
| ·糖基化对其它重组蛋白性质的影响 | 第58-59页 |
| ·展望 | 第59页 |
| 小结 | 第59-61页 |
| 第三节 重组瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅱ第124位N糖基化位点的敲除及突变体酶性质分析 | 第61-73页 |
| ·材料和方法 | 第61-63页 |
| ·菌株和质粒 | 第61页 |
| ·培养基和培养方法 | 第61页 |
| ·试剂,工具酶和仪器 | 第61页 |
| ·大肠杆菌转化,质粒的提取及分子克隆操作 | 第61-62页 |
| ·序列测定与分析 | 第62页 |
| ·定点突变 | 第62页 |
| ·酿酒酵母的转化 | 第62页 |
| ·酵母质粒的提取 | 第62-63页 |
| ·蛋白质电泳和活性染色 | 第63页 |
| ·pH和温度对酶活力的影响 | 第63页 |
| ·结果与分析 | 第63-70页 |
| ·敲除N124糖基化位点(N124H,N124D)的突变氨基酸的选择 | 第63-64页 |
| ·突变引物的设计 | 第64页 |
| ·敲除N124糖基化位点(N124H,N124D)的定点突变 | 第64-66页 |
| ·重组表达载体pAJ401-eg2-N124H和pAJ401-eg2-N124D的构建 | 第66-67页 |
| ·敲除N124糖基化位点后的突变酶(N124H,N124D)的酶学性质 | 第67-70页 |
| ·讨论 | 第70-71页 |
| ·重组EGⅡ第124位去N-糖基化后对突变重组酶性质的影响 | 第70页 |
| ·SDS-PAGE后活性染色在分离纯化中的作用 | 第70-71页 |
| ·展望 | 第71页 |
| 小结 | 第71-73页 |
| 第四节 重组内切葡聚糖酶Ⅱ第342位位点的饱和突变和此位点对酶最适pH和活性的影响 | 第73-87页 |
| ·材料和方法 | 第74-75页 |
| ·菌株和质粒 | 第74页 |
| ·培养基和培养方法 | 第74页 |
| ·试剂,工具酶与仪器 | 第74页 |
| ·对342位位点的饱和突变 | 第74页 |
| ·大肠杆菌转化、质粒的提取及分子克隆操作 | 第74页 |
| ·序列测定与分析 | 第74页 |
| ·酿酒酵母的转化 | 第74-75页 |
| ·酵母质粒的提取 | 第75页 |
| ·突变体酶的活力测定 | 第75页 |
| ·突变体酶最适pH的测定 | 第75页 |
| ·结果与分析 | 第75-83页 |
| ·饱和突变引物的设计 | 第75页 |
| ·重叠延伸法对342位位点的饱和突变 | 第75-77页 |
| ·N342A、N342E、N342M、N342W的定点突变 | 第77-79页 |
| ·各突变体酶的最适pH及其酶活力的比较 | 第79-82页 |
| ·酶蛋白的同源建模和结构分析 | 第82-83页 |
| ·讨论 | 第83-85页 |
| ·342位位点影响酶蛋白性质的作用机理分析 | 第83-84页 |
| ·饱和突变在定向进化中的应用 | 第84页 |
| ·展望 | 第84-85页 |
| 小结 | 第85-87页 |
| 第五节 重组内切葡聚糖酶Ⅱ的定向进化 | 第87-105页 |
| ·材料和方法 | 第87-89页 |
| ·菌株和质粒 | 第87页 |
| ·培养基和培养方法 | 第87页 |
| ·试剂,工具酶与仪器 | 第87页 |
| ·大肠杆菌转化、质粒的提取及分子克隆操作 | 第87页 |
| ·序列测定与分析 | 第87-88页 |
| ·酿酒酵母的转化和酵母质粒的提取 | 第88页 |
| ·突变菌株的筛选 | 第88页 |
| ·来源于酿酒酵母H158的突变体酶的分离纯化 | 第88页 |
| ·突变体酶的活力测定 | 第88页 |
| ·突变体酶最适pH的测定 | 第88页 |
| ·Km值的测定 | 第88-89页 |
| ·圆二色性谱测定 | 第89页 |
| ·结果与分析 | 第89-100页 |
| ·表达于酿酒酵母的定向进化流程 | 第89-90页 |
| ·使用GeneMorph Random Mutagenesis Kit进行的易错PCR | 第90-91页 |
| ·常规易错PCR | 第91-92页 |
| ·对突变体进行DNA重排 | 第92-95页 |
| ·突变频率的测定和突变体酶的筛选 | 第95页 |
| ·突变体酶的酶学性质 | 第95-100页 |
| ·讨论 | 第100-103页 |
| ·各突变点在酶蛋白上的位置及其影响酶学性质的机理分析 | 第100-102页 |
| ·定向进化技术在提高酶的最适pH和酶活性中的应用 | 第102-103页 |
| ·展望 | 第103页 |
| 小结 | 第103-105页 |
| 第六节 糖苷水解酶家族5中纤维素内切酶信息学研究 | 第105-119页 |
| ·材料和方法 | 第106-107页 |
| ·氨基酸序列的收集与氨基酸含量的计算 | 第106页 |
| ·纤维素内切酶最适pH的收集 | 第106页 |
| ·氨基酸含量与最适pH的回归方程的计算 | 第106页 |
| ·H+R、C+Y含量与最适pH的关系 | 第106-107页 |
| ·瑞氏木霉EGⅡ与已知三级结构的纤维素酶的序列比较 | 第107页 |
| ·结果与分析 | 第107-115页 |
| ·纤维素内切酶在糖苷水解酶家族中的分布 | 第107页 |
| ·糖苷水解酶家族5中纤维素内切酶的特征 | 第107-109页 |
| ·细菌和真核生物中纤维素内切酶氨基酸含量的特征 | 第109-110页 |
| ·糖苷水解酶家族5中纤维素内切酶的最适pH的预测方程 | 第110页 |
| ·氨基酸对最适pH的影响 | 第110-112页 |
| ·H+R含量与最适pH的关系 | 第112页 |
| ·C+Y含量与最适pH的关系 | 第112-113页 |
| ·瑞氏木霉EGⅡ与已知最适pH和三级结构的纤维素内切酶的比较 | 第113-115页 |
| ·讨论 | 第115-117页 |
| ·氨基酸含量对纤维素内切酶最适pH的影响 | 第115页 |
| ·其它因素对纤维素内切酶最适pH的影响 | 第115-116页 |
| ·展望 | 第116-117页 |
| 小结 | 第117-119页 |
| 第七节 瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅱ在黑曲霉中的表达 | 第119-139页 |
| ·材料和方法 | 第120-124页 |
| ·菌株和质粒 | 第120页 |
| ·培养基和培养方法 | 第120-121页 |
| ·试剂,工具酶与仪器 | 第121页 |
| ·原生质体的制备 | 第121页 |
| ·原生质体的再生及再生率的测定 | 第121-122页 |
| ·原生质体的转化 | 第122页 |
| ·大肠杆菌转化、质粒的提取及分子克隆操作 | 第122页 |
| ·序列测定与分析 | 第122页 |
| ·蛋白质电泳和活性染色 | 第122页 |
| ·黑曲霉基因组DNA的提取 | 第122-123页 |
| ·黑曲霉胞外内切葡聚糖酶活性测定 | 第123页 |
| ·Western Blot | 第123-124页 |
| ·结果与讨论 | 第124-135页 |
| ·菌丝培养方法对原生质体形成的影响 | 第124-125页 |
| ·菌龄对原生质体形成的影响 | 第125页 |
| ·酶及酶作用时间对原生质形成数量的影响 | 第125-126页 |
| ·酶解时间对原生质体再生率的影响 | 第126-127页 |
| ·渗透压稳定剂对原生质体形成和再生的影响 | 第127页 |
| ·原生质体释放的形态学观察 | 第127-128页 |
| ·再生培养方式的选择 | 第128页 |
| ·转化方法的选择 | 第128-129页 |
| ·自主复制型载体的构建 | 第129-130页 |
| ·表达有瑞氏木霉EGⅡ的自主复制型表达载体ANEp7-eg2和表达有瑞氏木霉EGⅡ的整合型表达载体ANIp7-eg2的构建 | 第130-133页 |
| ·来源于瑞氏木霉的EGⅡ在黑曲霉中的表达 | 第133-135页 |
| ·讨论 | 第135-137页 |
| ·原生质体的制备和转化丝状真菌 | 第135-136页 |
| ·黑曲霉作为表达宿主表达的重组蛋白 | 第136-137页 |
| ·展望 | 第137页 |
| 小结 | 第137-139页 |
| 全文总结与展望 | 第139-141页 |
| 1 本论文取得的创新性结果 | 第139-140页 |
| 2 本论文存在的问题及深入方向 | 第140-141页 |
| 参考文献 | 第141-171页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第171-173页 |
| 致谢 | 第173-174页 |
| 附件 | 第174-187页 |
