| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-12页 |
| 1 前言 | 第12-23页 |
| ·研究背景 | 第12-16页 |
| ·β-甘露聚糖酶研究历史和菌种选育 | 第12-13页 |
| ·β-甘露聚糖酶作用方式及结构分析 | 第13-14页 |
| ·β-甘露聚糖酶的分子生物学 | 第14-16页 |
| ·毕氏酵母表达外源基因的概述 | 第16-22页 |
| ·载体 | 第16-18页 |
| ·启动子 | 第18-19页 |
| ·信号肽序列 | 第19页 |
| ·选择标记 | 第19-20页 |
| ·菌株 | 第20页 |
| ·发酵及其影响因素 | 第20页 |
| ·糖基化 | 第20页 |
| ·缺陷及对策 | 第20-21页 |
| ·应用及前景 | 第21-22页 |
| ·实验目的与实验内容 | 第22-23页 |
| 2 材料 | 第23-26页 |
| ·菌株及载体 | 第23-24页 |
| ·试剂及培养基配制 | 第24-25页 |
| ·酶 | 第25-26页 |
| ·PCR引物 | 第26页 |
| ·仪器 | 第26页 |
| 3 方法 | 第26-44页 |
| ·野生酵母染色体DNA 提取 | 第26-29页 |
| ·菌株培养 | 第26页 |
| ·野生酵母染色体 DNA 提取 | 第26-28页 |
| ·比色法确定DNA浓度与纯度 | 第28-29页 |
| ·酵母25SrDNA 片段PCR 及分析 | 第29-31页 |
| ·25SrDNA 片段 PCR 扩增 | 第29-30页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳鉴定 | 第30-31页 |
| ·25SrDNA 片段序列分析 | 第31页 |
| ·高拷贝整合载体YIP5-rDNA 构建 | 第31-36页 |
| ·质粒DNA提取 | 第31-32页 |
| ·用无DNA酶的RNA酶处理质粒DNA | 第32-33页 |
| ·酵母25SrDNA PCR产物限制性内切酶消化 | 第33页 |
| ·质粒YIP5限制性内切酶消化 | 第33-34页 |
| ·酶切产物纯化 | 第34页 |
| ·酶切产物胶回收 | 第34-35页 |
| ·载体和25SrDNA PCR片段连接 | 第35页 |
| ·感受态细胞制备 | 第35-36页 |
| ·连接产物转化感受态细胞 | 第36页 |
| ·YIP5-rDNA 阳性克隆子筛选与鉴定 | 第36页 |
| ·高拷贝整合诱导型表达载体 YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ构建 | 第36-39页 |
| ·质粒pGEM-ManΙ限制性内切酶消化 | 第36-37页 |
| ·质粒pPIC9K 限制性内切酶消化 | 第37-38页 |
| ·质粒YIP5-rDNA 限制性内切酶消化 | 第38-39页 |
| ·半纤维素酶基因（ManⅠ）、强启动子（AOX1）与载体（YIP5-rDNA）连接 | 第39页 |
| ·YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ载体转化与筛选 | 第39页 |
| ·野生酵母菌对G418敏感性实验 | 第39页 |
| ·载体YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ与pAX15 共转化野生酵母菌 | 第39-41页 |
| ·载体YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ用SalⅠ线性化 | 第39-40页 |
| ·野生酵母细胞的准备 | 第40页 |
| ·共转化 | 第40页 |
| ·共转化阳性克隆子筛选与鉴定 | 第40-41页 |
| ·β-甘露聚糖酶基因的表达 | 第41-42页 |
| ·β-甘露聚糖酶提取及纯化 | 第41页 |
| ·二硝基水杨酸法测定β-甘露聚糖酶活力 | 第41-42页 |
| ·影响β-甘露聚糖酶基因表达的因素 | 第42-43页 |
| ·不同温度对β-甘露聚糖酶基因表达影响 | 第42-43页 |
| ·不同pH 对β-甘露聚糖酶基因表达影响 | 第43页 |
| ·不同溶氧对β-甘露聚糖酶基因表达影响 | 第43页 |
| ·ELISA双抗夹心法检测转β-甘露聚糖酶基因表达产物 | 第43-44页 |
| ·鼠抗β-甘露聚糖酶多克隆抗体（AB1）效价测定 | 第43-44页 |
| ·兔抗?-甘露聚糖酶多克隆抗体（AB2）效价测定 | 第44页 |
| ·ELISA双抗夹心法检测转β-甘露聚糖酶基因野生酵母菌表达产物 | 第44页 |
| 4 结果 | 第44-52页 |
| ·酵母基因组DNA 提取结果 | 第44页 |
| ·25SrDNA 片段PCR 结果 | 第44-45页 |
| ·25SrDNA 片段PCR 结果 | 第44-45页 |
| ·25SrDNA 片段PCR 产物序列分析结果 | 第45页 |
| ·野生酵母菌G418 敏感性实验结果 | 第45页 |
| ·YIP5-rDNA 载体鉴定结果 | 第45-46页 |
| ·YIP5-rDNA 载体大小鉴定结果 | 第45-46页 |
| ·YIP5-rDNA 载体的PCR 鉴定结果 | 第46页 |
| ·YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ载体鉴定结果 | 第46-48页 |
| ·YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ载体大小鉴定结果 | 第46-47页 |
| ·YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ载体酶切鉴定结果 | 第47-48页 |
| ·YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ载体的ManⅠ基因PCR 鉴定结果 | 第48页 |
| ·YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ载体的rDNA 片段 PCR 鉴定结果 | 第48页 |
| ·YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ和pAX15 载体的共转化野生酵母菌鉴定结果 | 第48-49页 |
| ·β-甘露聚糖酶基因在野生酵母菌中的表达与G418 抗性缺失 | 第49-50页 |
| ·影响共转化野生酵母菌目的基因表达的因素 | 第50-51页 |
| ·不同温度对β-甘露聚糖酶基因表达的影响 | 第50-51页 |
| ·不同 pH 对 β-甘露聚糖酶基因表达的影响 | 第51页 |
| ·不同溶氧条件对 β-甘露聚糖酶基因表达的影响 | 第51页 |
| ·β-甘露聚糖酶纯化结果 | 第51-52页 |
| ·ELASA检测结果 | 第52页 |
| 5 结论 | 第52-54页 |
| 致谢 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-62页 |
| 作者简介 | 第62页 |
