| 摘要 | 第1-16页 |
| ABSTRACT | 第16-20页 |
| 第一章 D-氨基酸的生物转化(综述) | 第20-55页 |
| 1 D-氨基酸 | 第20-34页 |
| ·D-氨基酸的分布 | 第20-24页 |
| ·D-氨基酸的特性及其代谢 | 第24-27页 |
| ·D-氨基酸的用途 | 第27-31页 |
| ·D-氨基酸的制备方法 | 第31-34页 |
| 2 D-海因酶(D-hydantoinase,HYD) | 第34-40页 |
| ·海因酶的性质 | 第35-37页 |
| ·海因酶的催化机理 | 第37页 |
| ·海因酶的结构 | 第37-40页 |
| 3 N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶(D-carbamoylase,CAB) | 第40-46页 |
| ·N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的性质 | 第41-43页 |
| ·N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的结构 | 第43-45页 |
| ·N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的催化机理 | 第45-46页 |
| 4 本论文的研究目的和意义 | 第46页 |
| 5 本论文的主要研究内容 | 第46-47页 |
| 参考文献 | 第47-55页 |
| 第二章 D-海因酶(HYD)的突变及其酶性质 | 第55-79页 |
| 第一节 易错PCR(Error-prone PCR) | 第55-64页 |
| 1 前言 | 第55页 |
| 2 材料 | 第55-57页 |
| ·菌株、质粒 | 第55-56页 |
| ·主要的酶、化学试剂和器材 | 第56页 |
| ·培养基 | 第56页 |
| ·寡聚核苷酸 | 第56-57页 |
| 3 方法 | 第57-59页 |
| ·易错PCR法扩增D-海因酶基因 | 第57-58页 |
| ·重组质粒的构建 | 第58页 |
| ·文库初步筛选方法 | 第58-59页 |
| 4 结果 | 第59-63页 |
| ·易错PCR条件的优化 | 第59-61页 |
| ·突变文库筛选方法的确立 | 第61页 |
| ·酶的基因序列 | 第61-62页 |
| ·酶的活性比较 | 第62页 |
| ·突变酶和重组酶的产量比较 | 第62-63页 |
| 5 讨论 | 第63-64页 |
| 第二节 定点突变(Site-directed mutagenesis) | 第64-69页 |
| 1 前言 | 第64页 |
| 2 材料 | 第64-66页 |
| ·菌株、质粒 | 第64页 |
| ·化学试剂 | 第64-65页 |
| ·主要的仪器设备 | 第65页 |
| ·寡聚核苷酸 | 第65-66页 |
| 3 方法 | 第66-67页 |
| ·扩增含有相应点突变的D-海因酶基因片段 | 第66页 |
| ·扩增含有相应点突变的D-海因酶全长基因序列 | 第66-67页 |
| ·重组质粒的构建 | 第67页 |
| ·定点突变后的D-海因酶活性测定 | 第67页 |
| 4 结果 | 第67-68页 |
| ·重组质粒的酶切验证 | 第67-68页 |
| ·定点突变后的D-海因酶活性 | 第68页 |
| ·突变酶HYD_(H409T)的纯化分析 | 第68页 |
| 5 讨论 | 第68-69页 |
| 第三节 缺失突变(Deletion mutation) | 第69-77页 |
| 1 前言 | 第69页 |
| 2 材料 | 第69-70页 |
| ·菌株、质粒 | 第69页 |
| ·试剂 | 第69-70页 |
| ·仪器 | 第70页 |
| 3 方法 | 第70-71页 |
| ·重组子的构建 | 第70页 |
| ·酶的表达与纯化 | 第70-71页 |
| ·酶活性测定 | 第71页 |
| ·分子量及分子形式的测定 | 第71页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第71页 |
| ·HPLC分析条件 | 第71页 |
| 4 结果 | 第71-77页 |
| ·酶的纯化,活性与分子形式 | 第71-74页 |
| ·酶的高级结构 | 第74页 |
| ·酶的pH稳定性 | 第74-75页 |
| ·酶的热稳定性 | 第75页 |
| ·酶的抗SDS能力 | 第75-77页 |
| 5 讨论 | 第77页 |
| 参考文献 | 第77-79页 |
| 第三章 N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶(CAB)的基因克隆及表达 | 第79-96页 |
| 第一节 N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶基因的克隆 | 第79-86页 |
| 1 前言 | 第79页 |
| 2 材料与方法 | 第79-81页 |
| ·材料 | 第79-80页 |
| ·方法 | 第80-81页 |
| 3 结果 | 第81-86页 |
| ·CAB基因的扩增与克隆 | 第81页 |
| ·CAB基因序列分析 | 第81页 |
| ·CAB氨基酸序列分析 | 第81-82页 |
| ·CAB的二级结构及三维结构同源建模 | 第82-86页 |
| 4 讨论 | 第86页 |
| 第二节 N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的表达及其性质 | 第86-93页 |
| 1 前言 | 第86-87页 |
| 2 材料与方法 | 第87-90页 |
| ·材料 | 第87-88页 |
| ·方法 | 第88-90页 |
| 3 结果 | 第90-93页 |
| ·重组子构建与表达的优化 | 第90页 |
| ·CAB基因的扩增及重组子pMD的鉴定 | 第90-92页 |
| ·融合基因在E.coli BL21(DE3)中的表达 | 第92页 |
| ·MBP-CAB的纯化 | 第92页 |
| ·融合蛋白酶活性 | 第92-93页 |
| ·融合蛋白的酶切分析 | 第93页 |
| 4 讨论 | 第93页 |
| 参考文献 | 第93-96页 |
| 第四章 HYD和CAB两酶基因的共转化及其表达条件 | 第96-105页 |
| 1 前言 | 第96页 |
| 2 材料 | 第96页 |
| 3 方法 | 第96-99页 |
| ·重组质粒构建 | 第96-97页 |
| ·双质粒共转化工程菌的诱导表达 | 第97-98页 |
| ·Western blot检测 | 第98-99页 |
| ·工程菌的活性检测 | 第99页 |
| 4 结果 | 第99-103页 |
| ·HYD和CAB在不同宿主菌中共表达的细胞活性比较 | 第99-100页 |
| ·工程菌的最适表达条件及SDS-PAGE分析 | 第100-101页 |
| ·共表达HYD和CAB的Western blot分析 | 第101页 |
| ·HYD和CAB串联表达、共表达工程菌同原始菌SS-ori的活力比较 | 第101-102页 |
| ·工程菌的底物专一性 | 第102-103页 |
| 5 讨论 | 第103页 |
| 参考文献 | 第103-105页 |
| 第五章 D-Valine的生物转化工艺研究 | 第105-113页 |
| 1 前言 | 第105-106页 |
| 2 试剂和仪器 | 第106页 |
| ·试剂 | 第106页 |
| ·仪器 | 第106页 |
| 3 方法 | 第106-107页 |
| ·高效液相色谱分离条件 | 第106页 |
| ·红外光谱测定方法 | 第106页 |
| ·核磁条件 | 第106-107页 |
| 4 结果 | 第107-111页 |
| ·D-缬氨酸纯化工艺 | 第107页 |
| ·比旋光度测定 | 第107页 |
| ·HPLC分析 | 第107页 |
| ·D-缬氨酸的红外图谱及其分析 | 第107-108页 |
| ·~1H NMR | 第108-111页 |
| 5 讨论 | 第111页 |
| 参考文献 | 第111-113页 |
| 第六章 生物转化DL-对羟基苯海因的HPLC分析 | 第113-119页 |
| 1 前言 | 第113页 |
| 2 实验材料 | 第113-114页 |
| ·仪器和试剂 | 第113页 |
| ·菌株和培养基 | 第113-114页 |
| 3 方法 | 第114页 |
| ·菌体培养与酶的表达 | 第114页 |
| ·色谱分离条件 | 第114页 |
| ·用菌体转化DL-对羟基苯海因的色谱分析 | 第114页 |
| 4 结果与讨论 | 第114-117页 |
| ·色谱条件的研究 | 第114-115页 |
| ·工作曲线的制作 | 第115-116页 |
| ·生物转化产物N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸的定量分析 | 第116页 |
| ·生物转化产物D-对羟基苯甘氨酸的定量分析 | 第116-117页 |
| 参考文献 | 第117-119页 |
| 附录 | 第119-120页 |
| 致谢 | 第120-121页 |
