| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 前言 | 第11-18页 |
| 1、布鲁氏菌病的病原学 | 第11-12页 |
| 2、布鲁氏菌病的流行概况 | 第12-13页 |
| 3、布鲁氏菌疫苗的研究进展 | 第13-15页 |
| 4、布鲁氏菌诊断方法的研究进展 | 第15-16页 |
| 5、蛋白芯片抗体谱 | 第16-17页 |
| 6、本研究的目的意义 | 第17-18页 |
| 第一部分 布鲁氏菌候选抗原蛋白的分析与筛选 | 第18-28页 |
| 1、布鲁氏菌的外膜蛋白质组分析 | 第18-20页 |
| 2、布鲁氏菌的分泌蛋白质组分析 | 第20-23页 |
| 3、毒力相关蛋白的挑选 | 第23-25页 |
| 4、鞭毛蛋白基因的挑选 | 第25-26页 |
| 5、布鲁氏菌的候选抗原基因 | 第26-28页 |
| 第二部分 布鲁氏菌蛋白的克隆与表达 | 第28-41页 |
| 1 材料 | 第28-29页 |
| ·菌株与载体 | 第28页 |
| ·主要试剂 | 第28-29页 |
| ·主要仪器 | 第29页 |
| 2 方法 | 第29-33页 |
| ·引物设计与合成 | 第29-30页 |
| ·基因的扩增和PCR产物的纯化 | 第30-31页 |
| ·基因的扩增 | 第30-31页 |
| ·PCR产物纯化 | 第31页 |
| ·入门克隆的构建(BP反应)与鉴定 | 第31-32页 |
| ·入门克隆的构建 | 第31-32页 |
| ·入门克隆的鉴定 | 第32页 |
| ·LR反应及重组表达载体的鉴定 | 第32-33页 |
| ·LR反应 | 第32-33页 |
| ·重组表达克隆的鉴定 | 第33页 |
| ·重组蛋白表达菌株 | 第33页 |
| ·目的基因的高效诱导表达 | 第33页 |
| 3 结果 | 第33-39页 |
| ·目的基因的扩增 | 第34页 |
| ·入门克隆的构建 | 第34-35页 |
| ·表达载体的筛选 | 第35-37页 |
| ·Gateway LR反应构建表达克隆 | 第37页 |
| ·目的基因的诱导表达 | 第37-38页 |
| ·Gateway克隆表达效率分析 | 第38-39页 |
| 4 讨论 | 第39-41页 |
| ·目标基因的扩增 | 第39页 |
| ·Gateway重组克隆 | 第39-40页 |
| ·表达载体的筛选与蛋白的诱导表达 | 第40-41页 |
| 第三部分 重组表达蛋白的表达与纯化 | 第41-51页 |
| 1 材料 | 第41-42页 |
| ·菌株 | 第41页 |
| ·主要试剂与溶液配制 | 第41-42页 |
| 2 方法 | 第42-44页 |
| ·蛋白的诱导表达条件的确立 | 第42-43页 |
| ·蛋白的诱导表达温度的确立 | 第42-43页 |
| ·蛋白的诱导表达IPTG诱导剂的确立 | 第43页 |
| ·蛋白的诱导表达时间的确立 | 第43页 |
| ·可溶性表达的分析 | 第43页 |
| ·蛋白的纯化 | 第43-44页 |
| ·包涵体蛋白变性条件下纯化 | 第43-44页 |
| ·可溶性蛋白纯化 | 第44页 |
| 3 结果 | 第44-49页 |
| ·诱导表达条件的优化与确立 | 第44-45页 |
| ·重组蛋白的可溶性分析 | 第45页 |
| ·重组融合蛋白纯化 | 第45-49页 |
| 4 讨论 | 第49-51页 |
| ·大肠杆菌表达条件的优化 | 第49页 |
| ·重组融合蛋白纯化条件的优化 | 第49-51页 |
| 第四部分 蛋白芯片的研制及分析方法的建立 | 第51-62页 |
| 1 材料 | 第51-52页 |
| ·主要试剂和溶液 | 第51-52页 |
| ·主要实验仪器 | 第52页 |
| 2 方法 | 第52-56页 |
| ·芯片的研制 | 第52-53页 |
| ·SPA的荧光素标记 | 第53-54页 |
| ·芯片反应条件的确立 | 第54-56页 |
| ·血清吸收 | 第54页 |
| ·封闭液的选择 | 第54-55页 |
| ·血清稀释度的确定 | 第55页 |
| ·二抗稀释度的确定 | 第55-56页 |
| 3 结果 | 第56-60页 |
| ·蛋白芯片的点制 | 第56页 |
| ·芯片反应条件的确立 | 第56-60页 |
| ·封闭液的选择 | 第56-57页 |
| ·血清稀释度的确定 | 第57-59页 |
| ·二抗稀释度的确定 | 第59-60页 |
| 4 讨论 | 第60-62页 |
| ·蛋白芯片点样 | 第60页 |
| ·蛋白芯片反应的优化 | 第60-62页 |
| 第五部分 布鲁氏菌血清抗体谱分析 | 第62-81页 |
| 1 材料 | 第62-64页 |
| ·主要试剂和溶液 | 第62-63页 |
| ·实验菌株、血清和实验动物 | 第63-64页 |
| ·主要实验仪器 | 第64页 |
| 2 方法 | 第64-66页 |
| ·免疫兔血清的反应 | 第64-65页 |
| ·布鲁氏菌M5疫苗株免疫兔血清的制备 | 第64-65页 |
| ·兔血清与蛋白芯片杂交 | 第65页 |
| ·免疫小鼠血清的反应 | 第65-66页 |
| ·布鲁氏菌免疫小鼠血清的制备 | 第65-66页 |
| ·小鼠血清与蛋白芯片反应 | 第66页 |
| ·布鲁氏菌病人血清的反应 | 第66页 |
| ·布鲁氏菌病患者的确诊 | 第66页 |
| ·布鲁氏菌病患者血清与蛋白芯片反应 | 第66页 |
| 3 结果 | 第66-77页 |
| ·免疫兔血清的反应 | 第66-70页 |
| ·布鲁氏菌不同免疫方式兔血清抗体谱分析 | 第66-67页 |
| ·活菌加强免疫对兔血清抗体谱的影响 | 第67-70页 |
| ·免疫小鼠血清的反应 | 第70-72页 |
| ·布鲁氏菌患者病人血清的反应 | 第72-73页 |
| ·免疫原性蛋白的汇总 | 第73-77页 |
| 4 讨论 | 第77-81页 |
| ·外膜、分泌蛋白抗体谱分析 | 第77-78页 |
| ·毒力相关蛋白抗体谱分析 | 第78页 |
| ·鞭毛蛋白抗体谱分析 | 第78-79页 |
| ·不同免疫方式血清抗体谱分析 | 第79页 |
| ·体液免疫与布鲁氏菌疫苗的研究 | 第79-80页 |
| ·体液免疫与布鲁氏菌诊断靶标的研究 | 第80-81页 |
| 全文总结 | 第81页 |
| 参考文献 | 第81-86页 |
| 附表-1 挑取出的207个基因的基因注释与扩增片段的长度 | 第86-91页 |
| 附表-2 候选免疫原性蛋白的表达引物 | 第91-96页 |
| 附表-3 缩略词表 | 第96-97页 |
| 在读期间发表论文 | 第97-99页 |
| 致谢 | 第99-100页 |