| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-27页 |
| 1.1 脂肪酶的简介 | 第13-16页 |
| 1.1.1 脂肪酶的结构特点和催化机理 | 第13-14页 |
| 1.1.2 脂肪酶的应用 | 第14-15页 |
| 1.1.3 脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第15-16页 |
| 1.2 Bmlipase-1与核型多角体病毒 | 第16-19页 |
| 1.2.1 家蚕对核型多角体病毒抗性研究 | 第16-17页 |
| 1.2.2 Bmlipase-1对家蚕核型多角体病毒抑制作用研究进展 | 第17-19页 |
| 1.3 毕赤酵母表达系统 | 第19-27页 |
| 1.3.1 毕赤酵母表达系统的简介 | 第19-22页 |
| 1.3.2 影响外源蛋白在毕赤酵母中高效表达的因素 | 第22-25页 |
| 1.3.3 密码子偏好性 | 第25-27页 |
| 第二章 引言 | 第27-31页 |
| 2.1 研究背景和意义 | 第27-28页 |
| 2.2 研究内容 | 第28-29页 |
| 2.3 技术路线 | 第29-31页 |
| 第三章 家蚕脂肪酶基因Bmlipase-1的克隆及生物信息学分析 | 第31-45页 |
| 3.1 实验材料 | 第31-32页 |
| 3.1.1 实验材料、菌株与载体 | 第31页 |
| 3.1.2 工具酶和试剂 | 第31页 |
| 3.1.3 主要试剂和培养基配制 | 第31-32页 |
| 3.1.4 主要仪器 | 第32页 |
| 3.2 实验方法 | 第32-37页 |
| 3.2.1 家蚕中肠组织总RNA的提取(TRIZOL法) | 第32-33页 |
| 3.2.2 反转录cDNA第一链的合成 | 第33-34页 |
| 3.2.3 目的基因的PCR扩增 | 第34页 |
| 3.2.4 Bmlipase-1基因片段的回收 | 第34-35页 |
| 3.2.5 Bmlipase-1基因片段与载体的连接 | 第35页 |
| 3.2.6 转化大肠杆菌E.coliDH5α | 第35页 |
| 3.2.7 阳性克隆的初步筛选 | 第35-36页 |
| 3.2.8 提取阳性克隆质粒 | 第36页 |
| 3.2.9 质粒双酶切验证及测序 | 第36-37页 |
| 3.2.10 Bmlipase-1的生物信息学分析 | 第37页 |
| 3.3 结果与分析 | 第37-42页 |
| 3.3.1 Bmlipase-1基因的RT-PCR扩增 | 第37-38页 |
| 3.3.2 阳性克隆的初步筛选 | 第38页 |
| 3.3.3 阳性克隆的双酶切验证及测序 | 第38-40页 |
| 3.3.4 Bmlipase-1的生物信息学分析 | 第40-42页 |
| 3.4 小结与讨论 | 第42-45页 |
| 第四章 毕赤酵母表达载体的构建 | 第45-59页 |
| 4.1 实验材料 | 第45-47页 |
| 4.1.1 菌株与载体 | 第45页 |
| 4.1.2 工具酶和试剂 | 第45页 |
| 4.1.3 主要试剂和培养基配方 | 第45-46页 |
| 4.1.4 主要仪器 | 第46-47页 |
| 4.2 实验方法 | 第47-52页 |
| 4.2.1 重组菌株质粒和穿梭质粒的提取 | 第47页 |
| 4.2.2 目的片段的PCR扩增和纯化 | 第47页 |
| 4.2.3 目的片段与载体的酶切和连接 | 第47-48页 |
| 4.2.4 连接产物转化大肠杆菌 | 第48页 |
| 4.2.5 阳性克隆的筛选与鉴定 | 第48-49页 |
| 4.2.6 重组质粒的提取及线性化 | 第49-50页 |
| 4.2.7 毕赤酵母感受态细胞的制备 | 第50页 |
| 4.2.8重组质粒电转化GS115 | 第50-51页 |
| 4.2.9 阳性克隆的初步筛选 | 第51页 |
| 4.2.10 阳性克隆测序鉴定 | 第51页 |
| 4.2.11 脂肪酶活性检测平板筛选 | 第51-52页 |
| 4.3 结果与分析 | 第52-58页 |
| 4.3.1 Bmlipase-1基因扩增及纯化 | 第52页 |
| 4.3.2 重组质粒pPICZαA-Bmlipase-1的构建和验证 | 第52-54页 |
| 4.3.3 重组酵母菌株GS115/pPICZαA-Bmlipase-1的构建与筛选 | 第54-56页 |
| 4.3.4 酵母转化子的基因组PCR及测序 | 第56-57页 |
| 4.3.5 脂肪酶活性检测平板筛选 | 第57-58页 |
| 4.4 小结与讨论 | 第58-59页 |
| 第五章 Bmlipase-1基因的密码子优化及重组毕赤酵母表达与分析 | 第59-77页 |
| 5.1 实验材料 | 第59-62页 |
| 5.1.1 菌株与载体 | 第59页 |
| 5.1.2 工具酶和试剂 | 第59-60页 |
| 5.1.3 主要试剂与培养基配方 | 第60-61页 |
| 5.1.4 主要仪器设备 | 第61-62页 |
| 5.2 实验方法 | 第62-66页 |
| 5.2.1 Bmlipase-1基因密码子的优化及全基因合成 | 第62页 |
| 5.2.2 重组毕赤酵母菌株的构建 | 第62页 |
| 5.2.3 酵母转化子的初步筛选 | 第62-63页 |
| 5.2.4 阳性克隆的PCR及测序鉴定 | 第63-64页 |
| 5.2.5 Bmlipase-1在毕赤酵母中的表达 | 第64页 |
| 5.2.6 发酵上清蛋白电泳检测 | 第64-65页 |
| 5.2.7 WesternBlotting检测 | 第65-66页 |
| 5.2.8 Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白 | 第66页 |
| 5.3 结果分析 | 第66-74页 |
| 5.3.1 Bmlipase-1基因密码子的优化及全基因合成 | 第66-69页 |
| 5.3.2 重组毕赤酵母菌株的构建 | 第69-70页 |
| 5.3.3 酵母转化子的初步筛选 | 第70-72页 |
| 5.3.4 阳性克隆测序鉴定 | 第72页 |
| 5.3.5 发酵上清SDS-PAGE检测 | 第72-74页 |
| 5.3.6 WesternBlotting检测和Ni-NTA亲和层析 | 第74页 |
| 5.4 小结与讨论 | 第74-77页 |
| 第六章 总结与讨论 | 第77-79页 |
| 参考文献 | 第79-87页 |
| 致谢 | 第87-89页 |
| 硕士期间发表的论文 | 第89页 |
