| 摘要 | 第4-10页 |
| Abstract | 第10-17页 |
| 引言 | 第23-26页 |
| 第一部分 miR-145在骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞系中的表达 | 第26-45页 |
| 1 前言 | 第26-27页 |
| 2 实验材料 | 第27-30页 |
| 2.1 组织标本和细胞系 | 第27-28页 |
| 2.1.1 组织标本 | 第27页 |
| 2.1.2 细胞系 | 第27-28页 |
| 2.2 引物 | 第28页 |
| 2.3 主要试剂 | 第28-29页 |
| 2.4 实验材料和仪器 | 第29-30页 |
| 3 实验方法 | 第30-34页 |
| 3.1 细胞培养 | 第30页 |
| 3.2 组织、细胞总RNA提取 | 第30-31页 |
| 3.2.1 组织总RNA的提取 | 第30页 |
| 3.2.3 细胞总RNA的提取 | 第30-31页 |
| 3.3 反转录反应 | 第31页 |
| 3.4 实时荧光定量PCR反应 | 第31-32页 |
| 3.5 免疫组化检测 | 第32页 |
| 3.6 统计学处理 | 第32-34页 |
| 4 结果 | 第34-39页 |
| 4.1 miR-145在骨肉瘤组织及癌旁组织中的表达情况 | 第34页 |
| 4.2 miR-145在骨肉瘤组织中的表达与临床病理学特征之间的相关性分析 | 第34-35页 |
| 4.3 miR-145在骨肉瘤细胞系及正常成骨细胞系中的表达差异 | 第35-36页 |
| 4.4 NEDD9在骨肉瘤组织中的表达 | 第36-38页 |
| 4.5 骨肉瘤组织中miR-145和NEDD9的相关性分析 | 第38-39页 |
| 5 讨论 | 第39-41页 |
| 6 小结 | 第41-42页 |
| 参考文献 | 第42-45页 |
| 第二部分 体外调控miR-145对骨肉瘤细胞侵袭转移和EMT的影响 | 第45-71页 |
| 1 前言 | 第45-47页 |
| 2 实验材料 | 第47-50页 |
| 2.1 细胞系 | 第47页 |
| 2.2 实验动物 | 第47页 |
| 2.3 引物 | 第47-48页 |
| 2.4 主要试剂和材料 | 第48-49页 |
| 2.5 主要实验仪器 | 第49-50页 |
| 3 实验方法 | 第50-58页 |
| 3.1 试剂配制 | 第50-51页 |
| 3.2 细胞转染 | 第51页 |
| 3.3 CCK8法检测骨肉瘤细胞MG63细胞增殖能力 | 第51页 |
| 3.4 Boyden Chamber检测转染miR-145mimics对骨肉瘤细胞MG63的侵袭能力的影响 | 第51-52页 |
| 3.5 划痕实验 | 第52页 |
| 3.6 实时荧光定量PCR检测miR-145及EMT相关分子:Snaill、E-cadherin、N-cadherin和vimentin的mRNA水平 | 第52-54页 |
| 3.6.1 细胞总RNA提取 | 第52-53页 |
| 3.6.2 测定提取的细胞总RNA浓度和纯度 | 第53-54页 |
| 3.7 Western blot检测骨肉瘤细胞系MG63中Snaill、E-cadherin、N-cadherin和vimentin蛋白的表达 | 第54-56页 |
| 3.7.1 细胞蛋白的提取 | 第54页 |
| 3.7.2 BCA法测定细胞蛋白浓度 | 第54-55页 |
| 3.7.3 SDS-PAGE电泳 | 第55页 |
| 3.7.4 转膜 | 第55页 |
| 3.7.5 封闭 | 第55-56页 |
| 3.7.6 与一抗反应 | 第56页 |
| 3.7.7 与二抗反应 | 第56页 |
| 3.7.8 ECL显色 | 第56页 |
| 3.8 体内水平检测miR-145表达对裸鼠移植瘤生长的影响 | 第56-57页 |
| 3.8.1 细胞准备 | 第56页 |
| 3.8.2 建立裸鼠移植瘤模型 | 第56-57页 |
| 3.8.3 检测移植瘤中相关分子的表达 | 第57页 |
| 3.8.4 免疫组化染色 | 第57页 |
| 3.9 统计学处理 | 第57-58页 |
| 4 结果 | 第58-66页 |
| 4.1 转染miR-145 mimics显著提高骨肉瘤细胞MG63 miR-145 mRNA的表达 | 第58页 |
| 4.2 转染miR-145 mimics对骨肉瘤细胞MG63增殖能力的影响 | 第58-59页 |
| 4.3 转染miR-145 mimics对骨肉瘤细胞MG63侵袭能力的影响 | 第59-60页 |
| 4.4 转染miR-145 mimics对骨肉瘤细胞MG63迁移能力的影响 | 第60-61页 |
| 4.5 转染miR-145 mimics对骨肉瘤MG63细胞EMT相关表型标志表达的影响 | 第61-63页 |
| 4.6 体内调控miR-145表达对裸鼠移植瘤的影响 | 第63-66页 |
| 4.6.1 转染miR-145 mimics对骨肉瘤MG63细胞裸鼠体内成瘤的影响 | 第63-64页 |
| 4.6.2 裸鼠移植瘤中EMT相关基因mRNA水平的检测 | 第64-65页 |
| 4.6.3 裸鼠移植瘤中EMT相关基因免疫组化检测 | 第65-66页 |
| 5 讨论 | 第66-68页 |
| 6 小结 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-71页 |
| 第三部分 miR-145调控骨肉瘤MG63细胞EMT发生的机制研究 | 第71-101页 |
| 1 前言 | 第71-72页 |
| 2 实验材料 | 第72-76页 |
| 2.1 主要试剂 | 第72页 |
| 2.2 主要仪器 | 第72页 |
| 2.3 细胞系 | 第72页 |
| 2.4 细菌 | 第72页 |
| 2.5 质粒 | 第72-74页 |
| 2.6 引物 | 第74-76页 |
| 3 实验方法 | 第76-82页 |
| 3.1 双荧光素酶报告实验 | 第76-79页 |
| 3.2 NEDD9 siRNA转染MG63细胞 | 第79-80页 |
| 3.3 miR-145 mimics转染 | 第80页 |
| 3.4 NEDD9 siRNA的rescue实验 | 第80页 |
| 3.5 实时荧光定量PCR检测MG63细胞转染NEDD9 siRNA后EMT相关分子的表达 | 第80-81页 |
| 3.6 Western blot检测MG63细胞转染NEDD9 siRNA后蛋白的表达 | 第81页 |
| 3.7 细胞迁移能力测定 | 第81页 |
| 3.8 细胞侵袭能力测定 | 第81-82页 |
| 4 结果 | 第82-95页 |
| 4.1 双荧光素酶报告实验 | 第82-88页 |
| 4.1.1 pmirGLO-NEDD9-3'UTR野生型/突变型重组载体的鉴定 | 第82-87页 |
| 4.1.2 双荧光素酶报告实验 | 第87-88页 |
| 4.2 miR-145通过NEDD9参与骨肉瘤细胞MG63细胞EMT发生 | 第88-95页 |
| 4.2.1 miR-145对NEDD9表达的调控作用 | 第88页 |
| 4.2.2 NEDD9 siRNA对骨肉瘤细胞MG63 NEDD9表达的影响 | 第88-89页 |
| 4.2.3 NEDD9 siRNA对骨肉瘤细胞MG63侵袭能力的影响 | 第89-90页 |
| 4.2.4 NEDD9 siRNA对骨肉瘤细胞MG63转移能力的影响 | 第90-91页 |
| 4.2.5 NEDD9 siRNA对骨肉瘤细胞MG63 EMT相关分子表达的影响 | 第91-92页 |
| 4.2.6 miR-145通过NEDD9促进骨肉瘤细胞MG63细胞EMT的发生 | 第92-95页 |
| 5 讨论 | 第95-98页 |
| 6 小结 | 第98-99页 |
| 参考文献 | 第99-101页 |
| 综述 | 第101-135页 |
| 参考文献 | 第121-135页 |
| 英文缩略词 | 第135-136页 |
| 个人简介 | 第136页 |
| 博士期间发表论文 | 第136-137页 |
| 致谢 | 第137页 |
