| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 第一章 绪论 | 第15-44页 |
| 1.1 病原学 | 第15-16页 |
| 1.2 分子生物学 | 第16-18页 |
| 1.2.1 基因组特征 | 第16页 |
| 1.2.2 遗传多样性 | 第16-17页 |
| 1.2.3 结构蛋白 | 第17-18页 |
| 1.3 衣壳蛋白 | 第18-23页 |
| 1.3.1 外源表达 | 第18-19页 |
| 1.3.2 受体结合 | 第19-23页 |
| 1.4 病毒进化 | 第23-31页 |
| 1.4.1 基因重组 | 第24-25页 |
| 1.4.2 突变进化 | 第25-28页 |
| 1.4.3 影响因素 | 第28-31页 |
| 1.5 食品安全 | 第31-34页 |
| 1.5.1 食品 | 第31-32页 |
| 1.5.2 水源 | 第32-33页 |
| 1.5.3 环境影响 | 第33-34页 |
| 1.6 检测方法 | 第34-41页 |
| 1.6.1 病毒提取 | 第34-37页 |
| 1.6.2 核酸抽提 | 第37页 |
| 1.6.3 电镜观察 | 第37-38页 |
| 1.6.4 免疫检测 | 第38页 |
| 1.6.5 PCR 检测 | 第38-41页 |
| 1.7 未来研究方向 | 第41-42页 |
| 1.8 本论文的目的意义与研究内容 | 第42-44页 |
| 1.8.1 目的意义 | 第42页 |
| 1.8.2 研究内容 | 第42-43页 |
| 1.8.3 技术路线 | 第43-44页 |
| 第二章 诺如病毒检测技术的标准化研究 | 第44-77页 |
| 2.1 材料 | 第44-47页 |
| 2.1.1 阳性样本 | 第44-45页 |
| 2.1.2 质粒与菌株 | 第45页 |
| 2.1.3 分子试剂 | 第45页 |
| 2.1.4 其他试剂 | 第45页 |
| 2.1.5 常用溶液 | 第45-47页 |
| 2.1.6 主要仪器 | 第47页 |
| 2.2 方法 | 第47-56页 |
| 2.2.1 检测引物 | 第47-48页 |
| 2.2.2 RNA 抽提 | 第48-50页 |
| 2.2.3 反转录 | 第50页 |
| 2.2.4 常规 PCR | 第50页 |
| 2.2.5 一步法 RT-PCR | 第50页 |
| 2.2.6 实时荧光定量 RT-PCR | 第50-51页 |
| 2.2.7 核酸电泳 | 第51页 |
| 2.2.8 凝胶回收 | 第51页 |
| 2.2.9 TA 克隆 | 第51-52页 |
| 2.2.10 菌落 PCR | 第52页 |
| 2.2.11 核酸序列测定 | 第52页 |
| 2.2.12 标准质粒构建 | 第52-53页 |
| 2.2.13 标准 cRNA 制备 | 第53页 |
| 2.2.14 病毒定量方法 | 第53页 |
| 2.2.15 电镜观察 | 第53-54页 |
| 2.2.16 核酸稳定性 | 第54页 |
| 2.2.17 超滤浓缩法 | 第54页 |
| 2.2.18 膜层析吸附法 | 第54-55页 |
| 2.2.19 酶联免疫板捕获病毒法 | 第55页 |
| 2.2.20 病毒回收率与浓缩倍数 | 第55页 |
| 2.2.21 质量控制 | 第55-56页 |
| 2.2.22 统计学分析 | 第56页 |
| 2.3 结果 | 第56-71页 |
| 2.3.1 电镜观察 | 第56页 |
| 2.3.2 标准质粒的构建 | 第56-57页 |
| 2.3.3 常规 PCR 引物扩增体系优化 | 第57-58页 |
| 2.3.4 常规 PCR 引物检测灵敏度评价 | 第58-59页 |
| 2.3.5 两步法实时荧光定量 RT-PCR 扩增体系优化 | 第59-60页 |
| 2.3.6 两步法实时荧光定量 RT-PCR 标准曲线建立 | 第60-61页 |
| 2.3.7 标准 cRNA 的制备 | 第61页 |
| 2.3.8 反转录体系优化 | 第61-63页 |
| 3.3.9 RTPCRU 与 PCRU 比较 | 第63页 |
| 2.3.10 一步法实时荧光定量 RT-PCR 扩增体系优化 | 第63-64页 |
| 2.3.11 一步法实时荧光定量 RT-PCR 标准曲线建立 | 第64-67页 |
| 2.3.12 RNA 提取效果评价 | 第67-68页 |
| 2.3.13 NoV 核酸稳定性研究 | 第68-69页 |
| 2.3.14 超滤浓缩法富集 NoV | 第69页 |
| 2.3.15 膜层析吸附法富集 NoV | 第69-70页 |
| 2.3.16 酶联免疫板捕获 NoV 法 | 第70-71页 |
| 2.4 讨论 | 第71-75页 |
| 2.5 小结 | 第75-77页 |
| 第三章 广州市冬季散发性腹泻中诺如病毒污染调查 | 第77-87页 |
| 3.1 材料 | 第77-78页 |
| 3.1.1 临床样本 | 第77-78页 |
| 3.1.2 质粒与菌株 | 第78页 |
| 3.1.3 分子试剂 | 第78页 |
| 3.1.4 其他试剂 | 第78页 |
| 3.1.5 主要仪器 | 第78页 |
| 3.2 方法 | 第78-81页 |
| 3.2.1 检测与克隆引物 | 第78-79页 |
| 3.2.2 临床样本处理 | 第79页 |
| 3.2.3 RNA 抽提 | 第79页 |
| 3.2.4 反转录 | 第79页 |
| 3.2.5 常规 PCR | 第79页 |
| 3.2.6 一步法 RT-PCR | 第79-80页 |
| 3.2.7 核酸电泳 | 第80页 |
| 3.2.8 凝胶回收 | 第80页 |
| 3.2.9 TA 克隆 | 第80页 |
| 3.2.10 菌落 PCR | 第80页 |
| 3.2.11 核酸序列测定 | 第80页 |
| 3.2.12 序列分析与系统发育树建立 | 第80页 |
| 3.2.13 病毒序列号 | 第80-81页 |
| 3.3 结果 | 第81-84页 |
| 3.3.1 病毒感染状况 | 第81页 |
| 3.3.2 NoV 序列比对与系统发育树建立 | 第81-83页 |
| 3.3.3 NoV 衣壳蛋白序列同源性分析 | 第83-84页 |
| 3.4 讨论 | 第84-86页 |
| 3.5 小结 | 第86-87页 |
| 第四章 GⅡ 型诺如病毒基因组克隆与序列分析 | 第87-123页 |
| 4.1 材料 | 第88页 |
| 4.1.1 阳性样本 | 第88页 |
| 4.1.2 质粒与菌株 | 第88页 |
| 4.1.3 分子试剂 | 第88页 |
| 4.1.4 其他试剂 | 第88页 |
| 4.1.5 主要仪器 | 第88页 |
| 4.2 方法 | 第88-93页 |
| 4.2.1 参考毒株序列的选择与预分型 | 第88页 |
| 4.2.2 基因组克隆策略与引物列表 | 第88-89页 |
| 4.2.3 GⅡ 型 NoV 基因组片段扩增 | 第89页 |
| 4.2.4 3′-cDNA 末端快速克隆技术 | 第89-90页 |
| 4.2.5 基因组片段克隆 | 第90页 |
| 4.2.6 核苷酸序列测定 | 第90页 |
| 4.2.7 基因组序列拼接、分析与系统发育树建立 | 第90页 |
| 4.2.8 基因组序列代表株选择与基因注释分析 | 第90-91页 |
| 4.2.9 序列同源性分析 | 第91页 |
| 4.2.10 序列进化分析 | 第91页 |
| 4.2.11 参照病毒序列号 | 第91-93页 |
| 4.3 结果 | 第93-118页 |
| 4.3.1 GⅡ 型 NoV 基因组序列收集 | 第93-95页 |
| 4.3.2 GⅡ 型 NoV 基因组扩增引物设计 | 第95-96页 |
| 4.3.3 基因组片段扩增结果 | 第96-97页 |
| 4.3.4 基因组扩增引物的灵敏度比较 | 第97页 |
| 4.3.5 实际样本中 GⅡ 型 NoV 基因组克隆与序列测定 | 第97-98页 |
| 4.3.6 NoV 基因组结构特征 | 第98-99页 |
| 4.3.7 基因组序列分析与系统发育树构建 | 第99页 |
| 4.3.8 GⅡ.4 型 NoV 蛋白序列分析 | 第99-111页 |
| 4.3.9 GⅡ 型 NoV 蛋白序列分析 | 第111-118页 |
| 4.4 讨论 | 第118-122页 |
| 4.5 小结 | 第122-123页 |
| 第五章 GⅡ.4 型诺如病毒衣壳蛋白进化分析 | 第123-158页 |
| 5.1 材料 | 第123页 |
| 5.2 方法 | 第123-125页 |
| 5.2.1 序列分型及比对分析 | 第123-124页 |
| 5.2.2 氨基酸位点的熵值计算 | 第124页 |
| 5.2.3 系统发育树的构建 | 第124-125页 |
| 5.2.4 同源建模与定位 | 第125页 |
| 5.3 结果 | 第125-152页 |
| 5.3.1 GⅡ.4 型 NoV 衣壳蛋白序列收集 | 第125-127页 |
| 5.3.2 衣壳序列中变异位点筛选 | 第127-129页 |
| 5.3.3 各基因簇内部变异位点分析 | 第129-135页 |
| 5.3.4 变异位点分类 | 第135-139页 |
| 5.3.5 同源建模 | 第139-141页 |
| 5.3.6 变异位点表面积计算 | 第141-146页 |
| 5.3.7 抗原表位预测及其进化特征分析 | 第146-152页 |
| 5.4 讨论 | 第152-156页 |
| 5.5 小结 | 第156-158页 |
| 结论与展望 | 第158-161页 |
| 参考文献 | 第161-180页 |
| 附录 | 第180-183页 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 | 第183-185页 |
| 致谢 | 第185-186页 |
| 答辩委员会对论文的评定意见 | 第186页 |
