| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-15页 |
| 前言 | 第15-35页 |
| 1、糖生物学 | 第15-17页 |
| ·糖链介导细胞识别与粘附 | 第15-16页 |
| ·糖链与信号转导 | 第16-17页 |
| ·糖链与肿瘤转移 | 第17页 |
| 2 糖基转移酶 | 第17-20页 |
| ·糖基转移酶的结构和功能 | 第18-19页 |
| ·糖基转移酶的反应 | 第19-20页 |
| 3 唾液酸与唾液酸转移酶 | 第20-29页 |
| ·唾液酸 | 第20页 |
| ·唾液酸转移酶 | 第20-23页 |
| ·唾液酸化的糖链及相应的唾液酸转移酶与肿瘤 | 第23-28页 |
| ·α 2,3连接唾液酸与肿瘤 | 第23-24页 |
| ·α 2,6连接唾液酸与肿瘤 | 第24-26页 |
| ·α 2,8连接的多聚唾液酸与肿瘤 | 第26页 |
| ·神经节苷脂与肿瘤 | 第26-28页 |
| ·多聚唾液酸与肿瘤 | 第28-29页 |
| ·多聚唾液酸 | 第28页 |
| ·多聚唾液酸的功能 | 第28-29页 |
| 4 α 2,8-唾液酸转移酶Ⅵ(ST8Sia Ⅵ)的研究进展 | 第29-34页 |
| ·α 2,8-唾液酸转移酶家族 | 第29-30页 |
| ·α 2,8-唾液酸转移酶Ⅰ(ST8Sia Ⅰ) | 第30页 |
| ·α 2,8-唾液酸转移Ⅲ(ST8Sia Ⅲ) | 第30页 |
| ·α 2,8-唾液酸转移酶Ⅱ和Ⅳ(ST8Sia Ⅱ和Ⅳ) | 第30-31页 |
| ·α 2,8-唾液酸转移酶Ⅴ(ST8Sia Ⅴ) | 第31页 |
| ·α 2,8-唾液酸转移酶Ⅵ(ST8Sia Ⅵ) | 第31-34页 |
| ·ST8Sia Ⅵ的结构 | 第31-32页 |
| ·ST8Sia Ⅵ的酶学性质 | 第32-34页 |
| 5 本论文的研究目的和技术路线 | 第34-35页 |
| 第一章 ST8Sia Ⅵ表达载体的构建 | 第35-52页 |
| 1 材料 | 第36-38页 |
| ·菌种和载体 | 第36-37页 |
| ·试剂 | 第37页 |
| ·仪器 | 第37页 |
| ·主要试剂的配制 | 第37-38页 |
| 2 LZRS-ST8Sia Ⅵ质粒的构建 | 第38-46页 |
| ·采用碱裂解法提取LZRS-MS-neo质粒和pRc/CMV-ST8Sia Ⅵ质粒 | 第38-39页 |
| ·以pRc/CMV-ST8Sia Ⅵ质粒为模板PCR扩增ST8Sia Ⅵ目的片段 | 第39-40页 |
| ·目的片段的胶回收 | 第40页 |
| ·ST8Sia Ⅵ目的片段与pMD18-T载体连接 | 第40-41页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第41页 |
| ·转化 | 第41-42页 |
| ·阳性克隆的筛选鉴定 | 第42页 |
| ·质粒PCR鉴定 | 第42-43页 |
| ·质粒双酶切鉴定 | 第43页 |
| ·单酶切LZRS-MS-neo质粒 | 第43页 |
| ·DNA片段的末端平滑化 | 第43-44页 |
| ·单酶切LZRS-MS-neo质粒 | 第44页 |
| ·片段与LZRS-MS-neo载体连接 | 第44-45页 |
| ·阳性克隆的筛选鉴定 | 第45页 |
| ·质粒双酶切鉴定 | 第45-46页 |
| 3 结果 | 第46-50页 |
| ·pMD18-T-ST8Sia Ⅵ载体的构建 | 第46-47页 |
| ·质粒的PCR鉴定 | 第46-47页 |
| ·质粒的酶切鉴定 | 第47页 |
| ·质粒LZRS-ST8Sia Ⅵ的构建 | 第47-50页 |
| ·LZRS-MS-neo载体双酶切回收 | 第47-48页 |
| ·质粒的PCR鉴定 | 第48-49页 |
| ·质粒的酶切鉴定 | 第49-50页 |
| 4 小结 | 第50页 |
| 5 讨论 | 第50-52页 |
| ·逆转录病毒载体的特点 | 第50-51页 |
| ·逆转录病毒载体的应用 | 第51页 |
| ·平滑末端DNA片段与载体的连接 | 第51-52页 |
| 第二章 小鼠肿瘤细胞ST8Sia Ⅵ过表达细胞株的构建 | 第52-65页 |
| 1 材料 | 第52-54页 |
| ·细胞株 | 第52页 |
| ·菌种和载体 | 第52页 |
| ·试剂 | 第52-53页 |
| ·仪器 | 第53页 |
| ·主要试剂的配制 | 第53-54页 |
| 2、方法 | 第54-59页 |
| ·细胞转染和阳性克隆筛选 | 第55-56页 |
| ·细胞培养 | 第55页 |
| ·慢病毒的制备 | 第55页 |
| ·慢病毒感染和细胞筛选实验 | 第55-56页 |
| ·ST8Sia Ⅵ mRNA表达的检测 | 第56-59页 |
| ·Trizol法提取细胞总RNA | 第56页 |
| ·反转录PCR(RT-PCR)制备cDNA | 第56-57页 |
| ·半定量PCR检测模板中ST8Sia Ⅵ mRNA的相对含量 | 第57页 |
| ·SYBR-Green Real-Time PCR定量检测模板中ST8Sia Ⅵ mRNA相对含量 | 第57-58页 |
| ·免疫印迹(Western blotting,WB) | 第58-59页 |
| ·检测ST8Sia Ⅵ对细胞膜糖链的修饰 | 第59页 |
| ·结果与计算 | 第59页 |
| 3 结果 | 第59-62页 |
| ·细胞ST8Sia Ⅵ mRNA的表达 | 第59-61页 |
| ·RNA的琼脂糖凝胶电泳分析 | 第59-60页 |
| ·半定量PCR检测ST8Sia Ⅵ mRNA水平的变化 | 第60-61页 |
| ·实时定量PCR检测ST8Sia Ⅵ mRNA水平的变化 | 第61页 |
| ·细胞ST8Sia Ⅵ蛋白水平的表达 | 第61-62页 |
| ·ST8Sia Ⅵ对细胞膜表面糖链的修饰 | 第62页 |
| 4 小结 | 第62-63页 |
| 5 讨论 | 第63-65页 |
| ·影响转染效率的主要因素 | 第63页 |
| ·逆转录病毒LZRS-MS-neo的特点 | 第63-65页 |
| 第三章 ST8Sia Ⅵ对小鼠乳腺癌细胞行为学的影响 | 第65-71页 |
| 1 材料 | 第65-66页 |
| ·试剂 | 第65-66页 |
| ·仪器 | 第66页 |
| 2 方法 | 第66-67页 |
| ·细胞及细胞复苏 | 第66-67页 |
| ·细胞培养及传代 | 第67页 |
| ·MTT法检测细胞增殖活性 | 第67页 |
| ·细胞迁移能力的检测 | 第67页 |
| ·统计学分析 | 第67页 |
| 3 结果 | 第67-69页 |
| ·细胞体外增殖的变化 | 第67-68页 |
| ·细胞体外迁移能力的变化 | 第68-69页 |
| 4 小结 | 第69页 |
| 5 讨论 | 第69-71页 |
| ·ST8Sia Ⅵ与肿瘤转移关系的体外研究 | 第70页 |
| ·二聚唾液酸结构的生物学意义 | 第70-71页 |
| 第四章 MAPK信号通路在ST8SiaⅥ介导的小鼠乳腺癌迁移过程中的作用 | 第71-85页 |
| 1 实验材料 | 第74页 |
| ·细胞株 | 第74页 |
| ·主要试剂 | 第74页 |
| ·主要仪器 | 第74页 |
| 2 实验方法 | 第74-76页 |
| ·MAPK活性(磷酸化)的检测 | 第75页 |
| ·IL-6刺激实验 | 第75页 |
| ·gp130和IL-6R免疫共沉淀实验 | 第75-76页 |
| ·AG490对MAPK活性抑制实验 | 第76页 |
| ·PD98059对MAPK活性抑制实验 | 第76页 |
| ·Transwell检测MAPK通路在细胞迁移过程中的作用 | 第76页 |
| 3 实验结果 | 第76-82页 |
| ·ST8SiaⅥ对MAPK信号的调节作用 | 第76-77页 |
| ·梯度实验 | 第77-80页 |
| ·IL-6梯度实验 | 第77-78页 |
| ·AG490梯度实验及AG490对MAPK活性抑制实验 | 第78-79页 |
| ·PD98059梯度实验 | 第79-80页 |
| ·gp130和IL-6R受体的糖基化检测 | 第80-81页 |
| ·Transwell检测MAPK通路在ST8SiaⅥ介导的乳腺癌细胞迁移过程中的作用 | 第81-82页 |
| 4 小结 | 第82页 |
| 5 讨论 | 第82-85页 |
| ·IL-6的多重生物学功能 | 第83页 |
| ·MAPK通路与gp130通路的相互作用 | 第83页 |
| ·唾液酸糖基化的检测 | 第83-85页 |
| 总结和展望 | 第85-86页 |
| 本研究论文的创新点 | 第86-87页 |
| 参考文献 | 第87-93页 |
| 致谢 | 第93-94页 |
| 个人简历 | 第94页 |
| 发表的学术论文 | 第94页 |
