| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-36页 |
| 1 前言 | 第14页 |
| 2 扣囊复膜酵母菌利用淀粉生产海藻糖 | 第14-17页 |
| 3 扣囊复膜酵母的淀粉酶 | 第17-23页 |
| ·α-淀粉酶 | 第17-19页 |
| ·葡糖淀粉酶 | 第19-22页 |
| ·可分解生淀粉的葡糖淀粉酶 | 第22-23页 |
| 4 扣囊复膜酵母的酸性蛋白酶 | 第23-25页 |
| 5 扣囊复膜酵母的β-葡萄糖苷酶 | 第25-26页 |
| 6 生产乙醇 | 第26-28页 |
| 7 扣囊复膜酵母的遗传学研究进展 | 第28页 |
| 8 葡萄糖阻遏 | 第28-30页 |
| ·不同水平的葡萄糖阻遏 | 第29页 |
| ·Mig1 复合体和葡萄糖阻遏之间的关系 | 第29页 |
| ·复合体和葡萄糖阻遏之间的关系 | 第29-30页 |
| 9 基因敲除的方法 | 第30-34页 |
| ·基因敲除的定义和应用 | 第30-31页 |
| ·基因敲除的常用方法 | 第31-34页 |
| ·利用同源重组技术进行基因敲除 | 第31-32页 |
| ·随机插入突变的基因敲除 | 第32-33页 |
| ·RNAi 技术进行基因敲除 | 第33-34页 |
| 10 本论文研究的目的和主要内容 | 第34-36页 |
| ·研究的目的 | 第34-35页 |
| ·研究的主要内容 | 第35-36页 |
| 第二章 扣囊复膜酵母A11 酸性蛋白酶基因敲除提高淀粉酶活性稳定性以及海藻糖含量 | 第36-64页 |
| 1 前言 | 第36-37页 |
| 2 材料和方法 | 第37-49页 |
| ·菌株和质粒 | 第37-38页 |
| ·实验菌株 | 第37页 |
| ·质粒 | 第37-38页 |
| ·培养基和试剂 | 第38-40页 |
| ·培养基 | 第38-39页 |
| ·试剂 | 第39-40页 |
| ·方法 | 第40-49页 |
| ·扣囊复膜酵母基因组DNA 的提取 | 第40页 |
| ·酸性蛋白酶基因敲除载体的构建 | 第40-44页 |
| ·扣囊复膜酵母A11 感受态的制备 | 第44-45页 |
| ·转化与筛选 | 第45页 |
| ·酸性蛋白酶的制备和活性的测定 | 第45-46页 |
| ·酸性蛋白酶基因敲除的验证 | 第46页 |
| ·生长曲线的测定 | 第46-47页 |
| ·形态学观察 | 第47页 |
| ·淀粉酶的制备和活性的测定 | 第47页 |
| ·不同温度对淀粉酶稳定性的影响 | 第47-48页 |
| ·外源重组酸性蛋白酶对淀粉酶稳定性的影响 | 第48页 |
| ·扣囊复膜酵母A11-a 海藻糠的积累及其含量的测定 | 第48-49页 |
| ·细胞干重的测定 | 第49页 |
| ·培养基中还原糖含量的测定 | 第49页 |
| 3 结果和讨论 | 第49-62页 |
| ·扣囊复膜酵母A11 基因组DNA 的提取 | 第49-50页 |
| ·酸性蛋白酶基因敲除载体的构建 | 第50-51页 |
| ·扣囊复膜酵母转化与筛选结果 | 第51-52页 |
| ·酸性蛋白酶活性的测定结果 | 第52页 |
| ·酸性蛋白酶基因敲除的验证结果 | 第52-55页 |
| ·PCR 验证结果 | 第52-53页 |
| ·牛奶平板上的水解透明圈的验证结果 | 第53-55页 |
| ·扣囊复膜酵母A11 和敲除菌株A11-a 的生长曲线 | 第55页 |
| ·形态学观察结果 | 第55-56页 |
| ·扣囊复膜酵母A11 和敲除菌株A11-a 的酸性蛋白酶、淀粉酶生产的变化 | 第56-58页 |
| ·淀粉酶热稳定性的变化 | 第58-59页 |
| ·外源重组酸性蛋白酶对淀粉酶稳定性的影响 | 第59-60页 |
| ·在摇瓶培养条件下海藻糖的积累 | 第60-61页 |
| ·细胞干重的测定结果 | 第61-62页 |
| ·培养基中还原糖含量的变化 | 第62页 |
| 4 本章小结 | 第62-64页 |
| 第三章 扣囊复膜酵母A11-a 高热敏渗透突变菌株的海藻糖积累与释放 | 第64-80页 |
| 1 前言 | 第64-65页 |
| 2 材料和方法 | 第65-70页 |
| ·菌株 | 第65页 |
| ·培养基和试剂 | 第65-66页 |
| ·培养基 | 第65页 |
| ·试剂 | 第65-66页 |
| ·方法 | 第66-70页 |
| ·亚硝基胍诱变扣囊复膜酵母A11-a 菌株 | 第66页 |
| ·高度热敏渗透突变菌株的分离 | 第66-67页 |
| ·分别用三氯乙酸和蒸馏水提取海藻糖 | 第67页 |
| ·酵母细胞在28℃和37℃下用蒸馏水和1.0 M 山梨醇处理 | 第67页 |
| ·摇瓶振荡培养下扣囊复膜酵母 A11-a 和突变菌株 A11-b 海藻糖的积累 | 第67-68页 |
| ·发酵培养下扣囊复膜酵母A11-b 海藻糖的积累 | 第68页 |
| ·细胞干重的测定 | 第68页 |
| ·发酵培养下还原糖和总糖含量的测定 | 第68-69页 |
| ·海藻糖的纯化 | 第69-70页 |
| 3 结果和讨论 | 第70-79页 |
| ·高热敏渗透菌株的诱变和筛选 | 第70-71页 |
| ·用三氯乙酸和蒸馏水提取海藻糖的比较 | 第71-73页 |
| ·酵母细胞在28℃和37℃下经蒸馏水和1.0 M 山梨醇处理的结果 | 第73-74页 |
| ·摇瓶振荡培养下扣囊复膜酵母A11-a 和突变菌株A11-b 海藻糖的积累和细胞生长量 | 第74-76页 |
| ·发酵培养下扣囊复膜酵母A11-b 海藻糖积累和细胞生长量 | 第76页 |
| ·扣囊复膜酵母A11-b 发酵培养下还原糖和总糖含量的变化 | 第76-77页 |
| ·海藻糖的纯化和结晶 | 第77-79页 |
| 4 本章小结 | 第79-80页 |
| 第四章 扣囊复膜酵母A11 的MIG1 基因克隆 | 第80-105页 |
| 1 前言 | 第80-82页 |
| 2 材料和方法 | 第82-89页 |
| ·菌株和质粒 | 第82页 |
| ·培养基和试剂 | 第82-83页 |
| ·培养基 | 第82页 |
| ·试剂 | 第82-83页 |
| ·方法 | 第83-89页 |
| ·扣囊复膜酵母A11 基因组DNA 的提取 | 第83页 |
| ·简并引物的设计 | 第83页 |
| ·简并引物PCR 扩增 | 第83-84页 |
| ·总RNA 提取 | 第84-85页 |
| ·RACE 方法扩增基因 | 第85-86页 |
| ·用HindⅢ酶切并环化基因组DNA，PCR 扩增 | 第86-87页 |
| ·用XbaI 酶切并环化基因组DNA，PCR 扩增 | 第87-88页 |
| ·MIG1 基因全长的获得 | 第88页 |
| ·MIG1 基因生物信息学分析 | 第88-89页 |
| 3 结果和讨论 | 第89-103页 |
| ·简并引物的设计 | 第89-91页 |
| ·简并引物PCR 扩增结果 | 第91-92页 |
| ·RNA 提取结果 | 第92-93页 |
| ·RACE 方法扩增基因结果 | 第93页 |
| ·用HindⅢ酶切并环化基因组DNA 及PCR 扩增结果 | 第93-94页 |
| ·用XbaI 酶切并环化基因组DNA 及PCR 扩增结果 | 第94-95页 |
| ·MIG1 基因生物信息学分析 | 第95-103页 |
| ·MIG1 基因全长的获得及推测ORF 框、氨基酸序列 | 第95-97页 |
| ·Mig1 蛋白氨基酸序列保守性 | 第97-99页 |
| ·Mig1 蛋白质保守区3D 结构预测 | 第99-100页 |
| ·MIG1 基因启动子预测 | 第100-101页 |
| ·Mig1 蛋白氨基酸序列糖基化位点分析 | 第101-102页 |
| ·Mig1 蛋白氨基酸序列信号肽预测 | 第102-103页 |
| 4 本章小结 | 第103-105页 |
| 第五章 扣囊复膜酵母A11 菌株的MIG1 基因对菌丝体形成、胞外酶合成及其表达的影响 | 第105-127页 |
| 1 前言 | 第105-106页 |
| 2 材料和方法 | 第106-115页 |
| ·菌株和质粒 | 第106页 |
| ·实验菌株 | 第106页 |
| ·质粒 | 第106页 |
| ·培养基和试剂 | 第106-107页 |
| ·培养基 | 第106-107页 |
| ·试剂 | 第107页 |
| ·方法 | 第107-115页 |
| ·扣囊复膜酵母基因组DNA 的提取 | 第107页 |
| ·MIG1 基因敲除载体的构建 | 第107-111页 |
| ·扣囊复膜酵母A11 感受态的制备 | 第111页 |
| ·转化与筛选 | 第111页 |
| ·MIG1 基因敲除的验证 | 第111-112页 |
| ·形态学观察 | 第112页 |
| ·扣囊复膜酵母A11 菌株和MIG1 基因敲除菌株 A11-c 生长曲线的测定 | 第112页 |
| ·酸性蛋白酶的制备和活性测定 | 第112页 |
| ·α-淀粉酶的制备和活性测定 | 第112-113页 |
| ·葡糖淀粉酶的制备和活性测定 | 第113页 |
| ·β-葡萄糖苷酶的制备和活性测定 | 第113-114页 |
| ·细胞干重的测定 | 第114页 |
| ·实时荧光定量PCR | 第114-115页 |
| 3 结果和讨论 | 第115-125页 |
| ·MIG1 基因敲除载体的构建 | 第115-116页 |
| ·扣囊复膜酵母转化与筛选结果 | 第116-118页 |
| ·MIG1 基因敲除的验证结果 | 第118-119页 |
| ·PCR 验证结果 | 第118-119页 |
| ·在2-脱氧-D-葡萄糖培养基中生长情况 | 第119页 |
| ·形态学观察结果 | 第119-121页 |
| ·扣囊复膜酵母A11 菌株和MIG1 基因敲除菌株A11-c 的生长曲线 | 第121-122页 |
| ·引物特异性验证结果 | 第122页 |
| ·MIG1 基因敲除菌株A11-c 和扣囊复膜酵母A11 菌株胞外酶生产及其它们基因的表达 | 第122-125页 |
| 4 本章小结 | 第125-127页 |
| 总结与创新点 | 第127-129页 |
| 参考文献 | 第129-141页 |
| 缩略语 | 第141-142页 |
| 致谢 | 第142-143页 |
| 作者简历 | 第143页 |
| 论文发表情况 | 第143页 |
