| 摘要 | 第7-10页 |
| Abstract | 第10-13页 |
| 符号说明 | 第14-15页 |
| 第一部分 对苯二酚1,2-双加氧酶PnpCD的结构与功能研究 | 第15-100页 |
| 第一章 前言 | 第15-36页 |
| 1.1 4-硝基酚(p-Nitrophenol, PNP)微生物降解的代谢途径与机理 | 第16-21页 |
| 1.1.1 4-硝基酚降解的厌氧代谢途径 | 第16-17页 |
| 1.1.2 4-硝基酚降解的主要代谢途径—有氧代谢 | 第17-19页 |
| 1.1.3 4-硝基酚微生物代谢的调控 | 第19-21页 |
| 1.2 对苯二酚双加氧酶PnpCD | 第21-26页 |
| 1.2.1 PnpCD参与Pseudomonas sp. strain WBC-3的4-硝基酚代谢 | 第21-22页 |
| 1.2.2 PnpCD属于双组分对苯二酚1，2-双加氧酶,由α和β两个亚基构成 | 第22-24页 |
| 1.2.3 双组分对苯二酚1,2-双加氧酶的催化性质、底物特异性分析 | 第24-25页 |
| 1.2.4 双组分对苯二酚1,2-双加氧酶属于单核非血红素Fe(Ⅱ)型双加氧酶 | 第25-26页 |
| 1.2.5 与单组分对苯二酚1,2-双加氧酶的比较 | 第26页 |
| 1.3 单核非血红素Fe(Ⅱ)型双加氧酶的催化反应机制研究 | 第26-33页 |
| 1.3.1 双加氧酶的广泛分布与功能多样化 | 第26-27页 |
| 1.3.2 双加氧酶与氧化酶及单加氧酶催化反应的区别 | 第27页 |
| 1.3.3 双加氧酶催化反应的起始—氧气分子的激活 | 第27-28页 |
| 1.3.4 依据参与激活氧气的辅因子类型对双加氧酶进行分类 | 第28-30页 |
| 1.3.5 单核非血红素Fe(Ⅱ)型双加氧酶及其相关的催化机制研究 | 第30-33页 |
| 1.4 课题的研究意义与内容 | 第33-36页 |
| 1.4.1 课题的研究意义 | 第33-34页 |
| 1.4.2 课题的研究内容 | 第34-36页 |
| 第二章 PnpCD复合物的表达、纯化和结晶 | 第36-67页 |
| 2.1 PnpC、PnpD的蛋白分析 | 第36-38页 |
| 2.2 PnpCD的同源蛋白PnpE1E2和PnpJ1J2 | 第38-39页 |
| 2.3 实验材料 | 第39-42页 |
| 2.3.1 菌株、基因组和载体 | 第39-40页 |
| 2.3.2 试剂、工具酶和服务 | 第40-41页 |
| 2.3.3 主要仪器 | 第41页 |
| 2.3.4 蛋白纯化缓冲液的配置 | 第41-42页 |
| 2.4 实验方法 | 第42-49页 |
| 2.4.1 基因的克隆 | 第42-45页 |
| 2.4.2 相应蛋白的表达和纯化 | 第45-47页 |
| 2.4.3 PnpCD复合物的限制性酶解 | 第47-48页 |
| 2.4.4 PnpCD Se-Met蛋白衍生物的制备 | 第48-49页 |
| 2.5 实验结果 | 第49-62页 |
| 2.5.1 PnpCD复合物的纯化 | 第49-54页 |
| 2.5.2 PnpJ1J2和PnpE1E2的蛋白纯化 | 第54-58页 |
| 2.5.3 PnpCD复合物的限制性酶解 | 第58-61页 |
| 2.5.4 PnpCDSe-Met蛋白的纯化 | 第61-62页 |
| 2.6 蛋白晶体的筛选与优化 | 第62-66页 |
| 2.6.1 结晶所需的材料与方法 | 第62-63页 |
| 2.6.2 PnpCD蛋白晶体的筛选与优化 | 第63-64页 |
| 2.6.3 PnpCD-底物类似物复合体晶体的优化 | 第64-65页 |
| 2.6.4 PnpCD Se-Met蛋白晶体的筛选与优化 | 第65-66页 |
| 2.7 本章小结 | 第66-67页 |
| 第三章 PnpCD复合物的结构解析 | 第67-75页 |
| 3.1 基本原理 | 第67-69页 |
| 3.1.1 X-射线衍射的基本原理 | 第67页 |
| 3.1.2 相角的确定与改善 | 第67-69页 |
| 3.2 实验材料和实施方法 | 第69-71页 |
| 3.2.1 实验材料 | 第69页 |
| 3.2.2 衍射数据收集和处理 | 第69-70页 |
| 3.2.3 相位求解和模型的搭建 | 第70页 |
| 3.2.4 结构的精修和模型评估 | 第70-71页 |
| 3.3 实验结果 | 第71-74页 |
| 3.4 本章小结 | 第74-75页 |
| 第四章 PnpCD复合物的结构与功能研究 | 第75-100页 |
| 4.1 实验材料和方法 | 第75-78页 |
| 4.1.1 突变体的构建 | 第75-76页 |
| 4.1.2 紫外分光光度计法检测PnpCD及其突变体的酶活 | 第76-77页 |
| 4.1.3 PnpCD的金属离子选择性 | 第77页 |
| 4.1.4 等温滴定量热法(ITC)检测氨基酸是否参与金属离子配位 | 第77-78页 |
| 4.2 PnpCD复合物的结构 | 第78-89页 |
| 4.2.1 异源四聚体α2β2 | 第78-80页 |
| 4.2.2 PnpC属于cupin超家族蛋白,但不发挥催化功能 | 第80-84页 |
| 4.2.3 PnpD的折叠方式和空间结构 | 第84-88页 |
| 4.2.4 PnpC与PnpD的相互作用分析 | 第88-89页 |
| 4.3 PnpCD催化hydroquinone开环裂解的机制研究 | 第89-97页 |
| 4.3.1 金属辅因子的结合位点及其配位状态 | 第90-94页 |
| 4.3.2 底物的结合位点 | 第94页 |
| 4.3.3 O_2可能的结合位点 | 第94-95页 |
| 4.3.4 底物、产物可能的进、出通道 | 第95页 |
| 4.3.5 PnpCD可能的催化机制 | 第95-97页 |
| 4.4 讨论 | 第97-99页 |
| 4.4.1 PnpD cupin结构域特殊的离子配位方式 | 第97-98页 |
| 4.4.2 PnpDN端结构域功能的探讨 | 第98-99页 |
| 4.5 本章小结 | 第99-100页 |
| 第二部分 二苯并噻吩单加氧酶DszC的结构和功能研究 | 第100-124页 |
| 第一章 前言 | 第100-105页 |
| 1.1 环境污染物二苯并噻吩(Dibenzothiophene,DBT) | 第100页 |
| 1.2 微生物降解二苯并噻吩的"4S途径" | 第100-102页 |
| 1.3 双组分单加氧酶DszC | 第102-103页 |
| 1.4 课题的研究意义与内容 | 第103-105页 |
| 1.4.1 课题的研究意义 | 第103页 |
| 1.4.2 课题的研究内容 | 第103-105页 |
| 第二章 DszC的结构和功能研究 | 第105-124页 |
| 2.1 DszC蛋白的纯化、结晶和结构解析 | 第105-111页 |
| 2.1.1 蛋白的1L可溶性检测和纯化 | 第105-108页 |
| 2.1.2 结晶条件的筛选和优化 | 第108-110页 |
| 2.1.3 数据处理和结构解析 | 第110-111页 |
| 2.2 DszC的整体结构 | 第111-113页 |
| 2.3 活性位点的"开/关"构象 | 第113-115页 |
| 2.4 辅因子FMN可能的结合位点分析 | 第115-119页 |
| 2.5 底物Dibenzothiophene和O_2可能的结合位点分析 | 第119-120页 |
| 2.6 讨论 | 第120-123页 |
| 2.6.1 活性位点的"开/关"构象 | 第120-121页 |
| 2.6.2 DszC的flavin选择性 | 第121页 |
| 2.6.3 DszC可能的催化机制 | 第121-123页 |
| 2.7 本章小结 | 第123-124页 |
| 全文总结 | 第124-127页 |
| 参考文献 | 第127-136页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 | 第136-137页 |
| 致谢 | 第137-138页 |
| 附件 | 第138页 |
