| 摘要 | 第1-4页 |
| Summary | 第4-12页 |
| 第一章 综述 | 第12-18页 |
| 1 研究目的与意义 | 第12-13页 |
| 2 体细胞克隆是生产抗病转基因猪的最有效方法 | 第13页 |
| 3 转基因动物抗病育种的国内外发展现状与趋势 | 第13-15页 |
| 4 抗口蹄疫病毒研究进展 | 第15-16页 |
| 5 整联蛋白与病毒感染 | 第16-18页 |
| 第二章 靶向FMDV 受体猪源整联蛋白αv 亚基基因抑制 FMDV 复制的最佳siRNA 筛选 | 第18-27页 |
| 1 材料 | 第18-19页 |
| ·细胞和口蹄疫病毒 | 第18页 |
| ·酶和试剂 | 第18页 |
| ·仪器设备 | 第18-19页 |
| 2 方法 | 第19-22页 |
| ·确定靶基因(αv) 、设计siRNA 的序列和化学合成 | 第19-20页 |
| ·siRNA 效果检测 | 第20-21页 |
| ·siRNA 转染PK-15 细胞和细胞的收集 | 第20页 |
| ·real-time RT-PCR 检测αv mRNA 表达 | 第20-21页 |
| ·细胞 RNA 的提取和纯化和 real-time RT-PCR | 第20页 |
| ·real-time RT-PCR 体系 | 第20-21页 |
| ·FMDV 对转染后PK-15 感染力的测定(TCID50) | 第21-22页 |
| ·siRNA 转染PK-15 和病毒液的收集 | 第21页 |
| ·FMDV 的测定(TCID50) | 第21-22页 |
| 3 结果 | 第22-25页 |
| ·siRNA 转染PK-15 后对αv 基因表达的影响 | 第22-23页 |
| ·FMDV 对转染后 pk-15 感染力的测定(TCID_(50)) | 第23-25页 |
| 4 讨论 | 第25-27页 |
| 第三章 RNAi 靶向猪源FMDV 受体亚基αv 基因慢病毒载体的构建 | 第27-33页 |
| 1 材料 | 第27-28页 |
| ·载体、菌种和细胞 | 第27页 |
| ·酶类和试剂 | 第27页 |
| ·仪器和设备 | 第27-28页 |
| 2 方法 | 第28-30页 |
| ·慢病毒载体的构建 | 第28-30页 |
| ·寡核苷酸的设计与合成 | 第28页 |
| ·iαv-U6 RNAi 进入质粒和 iαv-pLenti6/BLOCK-iT 表达质粒的构建 | 第28-29页 |
| ·iαv-pLenti6/BLOCK-iT?表达质粒的构建 | 第29页 |
| ·Blasticidin 对PK-15 细胞筛选浓度的测定 | 第29页 |
| ·慢病毒的包装 | 第29-30页 |
| ·慢病毒的功能性病毒滴度的测定 | 第30页 |
| ·慢病毒转导 PK-15 细胞 | 第30页 |
| ·抗性筛选阳性细胞 | 第30页 |
| 3 结果 | 第30-31页 |
| ·iαv-pLenti6/BLOCK-iT~(TM)表达质粒测序 | 第30-31页 |
| ·Blasticidin 对PK-15 细胞筛选浓度的测定 | 第31页 |
| ·功能慢病毒滴度的测定 | 第31页 |
| 4 讨论 | 第31-33页 |
| 第四章 iαv-pk-15 细胞中抑制FMDV 的复制 | 第33-40页 |
| 1 材料 | 第33-34页 |
| ·细胞和口蹄疫病毒 | 第33页 |
| ·酶和试剂 | 第33页 |
| ·仪器设备 | 第33-34页 |
| 2 方法 | 第34-36页 |
| ·慢病毒转导PK-15 后对αv 基因表达的影响 | 第34-36页 |
| ·MTT 法 | 第34页 |
| ·iαv-PK-15 细胞的冻存 | 第34-35页 |
| ·iαv-PK-15 细胞的复苏 | 第35页 |
| ·real-time RT-PCR 检测αv m RNA 表达 | 第35页 |
| ·间接免疫荧光检测细胞表面αv 蛋白表达 | 第35页 |
| ·Cell-ELISA 检测细胞表面αv 蛋白表达 | 第35-36页 |
| ·FMDV 对转基因细胞系PK-15 感染力的测定(TCID50) | 第36页 |
| 3 结论 | 第36-39页 |
| ·MTT 法 | 第36-37页 |
| ·稳定iαv-PK-15 细胞株的筛选 | 第37页 |
| ·慢病毒转导PK-15 对αv 基因表达的影响 | 第37-39页 |
| ·real-time RT-PCR 检测αv m RNA 表达水平 | 第37-38页 |
| ·细胞表面蛋白表达水平 | 第38-39页 |
| ·FMDV 的感染力的测定(TCID_(50))结果 | 第39页 |
| 4 讨论 | 第39-40页 |
| 第五章 转基因猪的培育 | 第40-45页 |
| 1 材料 | 第40-41页 |
| ·慢病毒和体细胞 | 第40页 |
| ·酶类和试剂 | 第40-41页 |
| ·仪器和设备 | 第41页 |
| 2 方法 | 第41-43页 |
| ·Blasticidin 对成纤维细胞筛选浓度的测定 | 第41页 |
| ·卵巢采集和采卵子 | 第41页 |
| ·捡卵 | 第41-42页 |
| ·去核与核移植 | 第42页 |
| ·电融合 | 第42页 |
| ·胚胎成熟 | 第42页 |
| ·胚胎移植 | 第42页 |
| ·受孕母猪的管理 | 第42-43页 |
| 3 结果 | 第43-44页 |
| ·Blasticidin 对体细胞筛选浓度的测定 | 第43页 |
| ·实验过程图解结果 | 第43-44页 |
| 4 讨论 | 第44-45页 |
| 第六章 结论 | 第45-46页 |
| 致谢 | 第46-48页 |
| 参考文献 | 第48-55页 |
| 附录 | 第55-59页 |
| 导师简介 | 第59-60页 |
| 作者简介 | 第60-61页 |
