| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 前言 | 第9-14页 |
| 1、斑马鱼概述 | 第9页 |
| 2、斑马鱼胚胎心脏发育概述 | 第9-10页 |
| 3、先天性心脏病与gata4基因概述 | 第10-11页 |
| 4、TALEN技术 | 第11-13页 |
| ·TALEN技术简介 | 第11页 |
| ·TALEN技术的原理 | 第11-12页 |
| ·TALEN的构建方法 | 第12-13页 |
| ·TALEN技术应用 | 第13页 |
| 5、CRISPR/CAS9技术 | 第13页 |
| 6、本文的研究意义 | 第13-14页 |
| 材料和方法 | 第14-27页 |
| 实验材料 | 第14-16页 |
| 1、实验动物 | 第14页 |
| 2、菌种、质粒 | 第14页 |
| 3、工具酶 | 第14页 |
| 4、试剂盒 | 第14页 |
| 5、其他试剂 | 第14页 |
| 6、主要仪器及耗材 | 第14-15页 |
| 7、主要试剂配制 | 第15-16页 |
| 实验方法 | 第16-27页 |
| 1、基本方法 | 第16-24页 |
| ·斑马鱼gata4基因的提取 | 第16页 |
| ·引物设计与合成 | 第16-17页 |
| ·PCR扩增目的片段 | 第17页 |
| ·电泳检测PCR产物 | 第17-18页 |
| ·普通PCR产物纯化 | 第18页 |
| ·质粒的提取 | 第18-19页 |
| ·质粒的双酶切鉴定 | 第19页 |
| ·普通琼脂糖凝胶DNA回收 | 第19-20页 |
| ·连接 | 第20页 |
| ·氯化钙法制备感受态细胞 | 第20-21页 |
| ·转化 | 第21页 |
| ·阳性克隆的筛选与鉴定 | 第21页 |
| ·体外转录 | 第21-22页 |
| ·斑马鱼饲养及繁殖 | 第22-23页 |
| ·斑马鱼的饲养环境 | 第22页 |
| ·斑马鱼饲料 | 第22-23页 |
| ·斑马鱼的雌雄鉴别 | 第23页 |
| ·受精产卵 | 第23页 |
| ·胚胎孵化 | 第23页 |
| ·幼鱼的培育 | 第23页 |
| ·显微注射 | 第23-24页 |
| ·测序 | 第24页 |
| 2、TALEN实验流程 | 第24-27页 |
| ·敲除靶点的选择与确认 | 第24-25页 |
| ·采用“单元组装法”构建pMD-TALE载体 | 第25页 |
| ·构建TALEN表达终载体 | 第25-26页 |
| ·TALENs质粒体外转录 | 第26页 |
| ·TALEN体内活性检测 | 第26页 |
| ·斑马鱼gata4敲除动物模型检测 | 第26-27页 |
| 结果与分析 | 第27-38页 |
| 1、斑马鱼gata4基因的靶点分析结果 | 第27页 |
| 2、gata4基因扩增与敲除靶点比对 | 第27-28页 |
| 3、“单元组装法”构建pMD-TALE载体 | 第28-32页 |
| ·左半位点(pMD-TALE-L)、右半位点(pMD-TALE-R)构建方案 | 第28-29页 |
| ·左半位点(pMD-TALE-L)、右半位点(pMD-TALE-R)构建过程 | 第29-32页 |
| 4、pCS2-PEAS-L和pCS2-PERR-R终载体的构建与鉴定 | 第32-33页 |
| 5、TALEN体内活性检测 | 第33-35页 |
| 6、斑马鱼gata4敲除动物模型检测 | 第35-38页 |
| ·酶切法检测TALEN敲除效率 | 第35-36页 |
| ·F_0代基因型检测 | 第36页 |
| ·斑马鱼胚胎心脏结构观察及心率的测量 | 第36-38页 |
| 讨论 | 第38-41页 |
| 结论 | 第41-42页 |
| 参考文献 | 第42-46页 |
| 附录1：综述 | 第46-55页 |
| 参考文献 | 第50-55页 |
| 附录2：中英文缩略词表 | 第55-57页 |
| 附录3：所用载体信息 | 第57-58页 |
| 附录4：测序结果 | 第58-59页 |
| 附录5：个人简介 | 第59-60页 |
| 致谢 | 第60-61页 |
