| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-10页 |
| 前言 | 第10-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-26页 |
| 1. 酶的特征 | 第13-16页 |
| ·flavastacin | 第13页 |
| ·peptidyl-Asp metalloendopeptidase | 第13-14页 |
| ·内肽酶 AspN 的反应前对蛋白的处理 | 第14-16页 |
| 2. 蛋白表达系统 | 第16-17页 |
| 3. 大肠杆菌表达蛋白的具体过程 | 第17-19页 |
| ·获得目的基因 | 第17页 |
| ·构建重组表达载体 | 第17-18页 |
| ·获得含有重组质粒的菌株 | 第18页 |
| ·蛋白的诱导表达 | 第18-19页 |
| 4. 蛋白的纯化 | 第19-22页 |
| ·亲和层析 | 第19-20页 |
| ·凝胶过滤层析 | 第20页 |
| ·离子交换层析 | 第20-21页 |
| ·疏水层析 | 第21页 |
| ·反相层析 | 第21-22页 |
| 5. 活性检测 | 第22-23页 |
| ·高效液相色谱 | 第22-23页 |
| ·质谱 | 第23页 |
| 6. 包涵体复性 | 第23-24页 |
| 7. DoE | 第24-26页 |
| 第二章 重组内肽酶 AspN(flavastacin)表达载体的构建和融合蛋白的表达与纯化 | 第26-47页 |
| ·材料与方法 | 第26-29页 |
| ·实验方法 | 第29-36页 |
| ·flavastacin/pET32a 的构建 | 第29-34页 |
| ·目的蛋白的诱导表达条件的优化 | 第34页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第34-35页 |
| ·目的蛋白的鉴定 | 第35-36页 |
| ·实验结果 | 第36-45页 |
| ·目的基因的获得 | 第36-37页 |
| ·重组质粒构建 | 第37-39页 |
| ·蛋白表达 | 第39-40页 |
| ·蛋白纯化 | 第40-45页 |
| ·讨论 | 第45-47页 |
| ·表达系统 | 第45页 |
| ·诱导表达 | 第45页 |
| ·蛋白纯化 | 第45页 |
| ·标签切除 | 第45-46页 |
| ·酶的性质 | 第46-47页 |
| 第三章 重组内肽酶 AspN (Peptidyl-Asp metalloendopeptid- ase)表达载体的构建和融合蛋白的表达与纯化 | 第47-71页 |
| ·材料与方法 | 第47-48页 |
| ·实验方法 | 第48-55页 |
| ·目的片段的获得 | 第48页 |
| ·获得重组质粒的菌株 | 第48-54页 |
| ·蛋白纯化 | 第54页 |
| ·Tricine-SDS-PAGE 电泳凝胶 | 第54-55页 |
| ·实验结果 | 第55-70页 |
| ·目的基因的获得 | 第55页 |
| ·重组质粒的构建 | 第55-61页 |
| ·蛋白表达 | 第61-62页 |
| ·蛋白纯化 | 第62-68页 |
| ·蛋白复性 | 第68-70页 |
| ·讨论 | 第70-71页 |
| 第四章 内肽酶 AspN 的活性鉴定 | 第71-77页 |
| ·材料与方法 | 第71-72页 |
| ·材料 | 第71页 |
| ·实验方法 | 第71-72页 |
| ·实验结果 | 第72-75页 |
| ·HPLC 分析酶活性 | 第72-73页 |
| ·SDS-PAGE 分析酶活性 | 第73-74页 |
| ·荧光实验分析酶活性 | 第74-75页 |
| ·讨论 | 第75-77页 |
| 第五章 总结 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-81页 |
| 附录 | 第81-96页 |
| 致谢 | 第96-97页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第97页 |
