| 摘要 | 第1-14页 |
| ABSTRACT | 第14-19页 |
| 引言 | 第19-21页 |
| 第一篇 文献综述 | 第21-65页 |
| 第一章 转基因动物研发现状的研究进展 | 第21-45页 |
| 1 传统转基因技术 | 第22-23页 |
| ·显微注射法 | 第22页 |
| ·精子载体法 | 第22页 |
| ·逆转录病毒感染法 | 第22页 |
| ·胚胎干细胞介导法 | 第22-23页 |
| 2 现代的转基因技术 | 第23-34页 |
| ·体细胞核移植技术 | 第23-24页 |
| ·基因打靶技术 | 第24-28页 |
| ·RNA干扰介导的基因沉默技术 | 第28-29页 |
| ·慢病毒载体技术 | 第29-30页 |
| ·诱导多能干细胞转基因技术 | 第30-32页 |
| ·多基因转基因表达策略和分时段的调控表达策略 | 第32-34页 |
| 3 乳腺的进化、发育及泌乳调节 | 第34-41页 |
| ·乳腺发育及泌乳 | 第34-35页 |
| ·激素和细胞因子对乳腺发育的影响 | 第35-37页 |
| ·影响乳腺的进化和泌乳的基因 | 第37-38页 |
| ·影响乳腺表达的其它因素 | 第38-41页 |
| 4 IGF-1的功能及其与泌乳的关系 | 第41-45页 |
| ·IGF-I基因的结构及定位 | 第41页 |
| ·IGF-1的生物活性 | 第41-42页 |
| ·IGF-1与乳腺发育以及泌乳之间的关系 | 第42-45页 |
| 第二章 提高转基因阳性细胞筛选效率的几种策略 | 第45-56页 |
| 1 转基因研究的瓶颈 | 第45-47页 |
| ·转基因供体阳性细胞筛选效率过低,转基因总体效率低下 | 第45页 |
| ·外源基因表达不稳定,表达水平低下 | 第45-46页 |
| ·插入的基因的位置难以控制 | 第46-47页 |
| 2 外源DNA克服屏障进入细胞的机制 | 第47-49页 |
| ·细胞内吞机制 | 第47-48页 |
| ·溶酶体逃避的机制 | 第48页 |
| ·胞质内的运输 | 第48-49页 |
| ·外源DNA进入细胞核的途径 | 第49页 |
| 3 核定位信号肽促进DNA入核,增加转染效率 | 第49-53页 |
| ·核定位信号的分类 | 第50-51页 |
| ·核定位信号介导的入核机制 | 第51页 |
| ·核输入的结构基础及调控 | 第51-52页 |
| ·核定位信号肽及其复合物的应用 | 第52-53页 |
| 4 双亲性小分子作用细胞增加转染效率 | 第53-56页 |
| ·双亲性小分子与核孔复合体之间的相互作用 | 第53-54页 |
| ·双亲性小分子增加转染效率的研究 | 第54-56页 |
| 参考文献 | 第56-65页 |
| 第二篇 试验研究 | 第65-153页 |
| 第三章 山羊乳腺特异性表达载体PIN的构建及其功能验证 | 第65-83页 |
| 摘要 | 第65-66页 |
| 前言 | 第66页 |
| 1 材料和方法 | 第66-72页 |
| ·材料和仪器 | 第66-69页 |
| ·类胰岛素生长因子(IGF-1)基因的克隆 | 第69页 |
| ·标记基因新霉素(neo)的克隆 | 第69页 |
| ·乳腺特异性表达载体pIN的构建与验证 | 第69-70页 |
| ·乳腺特异性表达载体pIN的生物学功功能验证 | 第70-72页 |
| ·数据分析 | 第72页 |
| 2 试验结果 | 第72-77页 |
| ·igf-1基因和neo基因的克隆与分析 | 第72-73页 |
| ·乳腺特异性表达载体pIN的鉴定 | 第73页 |
| ·乳腺特异性表达载体pIN的生物学功功能验证 | 第73-77页 |
| 3 讨论 | 第77-80页 |
| 参考文献 | 第80-83页 |
| 第四章 双亲性小分子DMSO和薄荷醇增加转染效率的研究 | 第83-99页 |
| 摘要 | 第83-84页 |
| 前言 | 第84页 |
| 1 材料和方法 | 第84-88页 |
| ·材料和仪器 | 第84-86页 |
| ·MTT细胞毒性试验确定DMSO和薄荷醇使用浓度 | 第86-87页 |
| ·荧光定量PCR检测DMSO和薄荷醇处理对细胞转染效率的影响 | 第87页 |
| ·荧光显微镜观察DMSO和薄荷醇处理对细胞转染效率的影响 | 第87页 |
| ·流式细胞检测DMSO和薄荷醇处理对细胞转染效率的影响 | 第87-88页 |
| ·流式细胞检测DMSO和薄荷醇作用对细胞周期的影响 | 第88页 |
| ·数据分析 | 第88页 |
| 2 试验结果 | 第88-94页 |
| ·MTT法检测不同浓度DMSO和薄荷醇对细胞的细胞毒性作用 | 第88-89页 |
| ·荧光定量PCR检测转染效率 | 第89-90页 |
| ·荧光显微镜观察转染情况 | 第90-92页 |
| ·流式细胞检测转染效率 | 第92页 |
| ·流式细胞检测DMSO和薄荷醇作用对细胞周期的影响 | 第92-94页 |
| 3 讨论 | 第94-96页 |
| 参考文献 | 第96-99页 |
| 第五章 核定位信号肽增加转染效率的研究 | 第99-117页 |
| 摘要 | 第99-100页 |
| 前言 | 第100页 |
| 1 材料和方法 | 第100-105页 |
| ·材料和仪器 | 第100-102页 |
| ·NLS/DNA和SPB-NLS/DNA复合物的制备 | 第102页 |
| ·琼脂糖凝胶阻滞试验 | 第102-103页 |
| ·NLS和SPB-NLS对转染效率的影响 | 第103-104页 |
| ·流式细胞分析NLS和SPB-NLS对细胞周期的影响 | 第104页 |
| ·激光共聚焦观察NLS和SPB-NLS协助质粒DNA入核情况 | 第104页 |
| ·Western-blot检测SPB-NLS介导的质粒在山羊乳腺上皮细胞上的表达情况 | 第104-105页 |
| ·数据分析 | 第105页 |
| 2 试验结果 | 第105-113页 |
| ·琼脂糖凝胶阻滞试验确定最佳DNA与NLS/SPB-NLS的复合浓度 | 第105-107页 |
| ·NLS和SPB-NLS对转染效率的影响 | 第107-109页 |
| ·流式检测NLS和SPB-NLS介导的转染对细胞周期的影响 | 第109-110页 |
| ·激光共聚焦观察质粒DNA的入核情况 | 第110-112页 |
| ·Western-blot检测SPB-NLS介导的质粒在山羊乳腺上皮细胞上的表达情况 | 第112-113页 |
| 3 讨论 | 第113-115页 |
| 参考文献 | 第115-117页 |
| 第六章 转IGF-1基因阳性克隆细胞的筛选及转IGF-1基因奶山羊的制备 | 第117-131页 |
| 摘要 | 第117-118页 |
| 前言 | 第118页 |
| 1 材料和方法 | 第118-122页 |
| ·材料和仪器 | 第118-120页 |
| ·小羊耳皮成纤维细胞的分离和G418梯度抗性试验 | 第120页 |
| ·乳腺特异性表达载体pIN转染成纤维细胞与细胞筛选 | 第120-121页 |
| ·单克隆阳性细胞的PCR验证 | 第121-122页 |
| ·核移植转IGF-1基因奶山羊的制备 | 第122页 |
| ·数据分析 | 第122页 |
| 2 试验结果 | 第122-125页 |
| ·奶山羊胎儿成纤维细胞和小羊耳皮成纤维细胞G418梯度抗性试验 | 第122-123页 |
| ·乳腺特异性表达载体pIn转染成纤细胞及细胞筛选 | 第123页 |
| ·单克隆阳性细胞的PCR验证 | 第123-124页 |
| ·转pIN基因奶山羊的制备情况 | 第124-125页 |
| 3 讨论 | 第125-127页 |
| 参考文献 | 第127-131页 |
| 第七章 转IGF-1基因奶山羊的鉴定 | 第131-153页 |
| 摘要 | 第131-132页 |
| 前言 | 第132-133页 |
| 1 材料和方法 | 第133-140页 |
| ·材料和仪器 | 第133-134页 |
| ·PCR鉴定转IGF-1基因奶山羊 | 第134-135页 |
| ·Southern-blot鉴定转IGF-1基因奶山羊 | 第135-136页 |
| ·荧光定量PCR鉴定转IGF-1基因奶山羊插入基因拷贝数 | 第136-137页 |
| ·TAIL-PCR鉴定转IGF-1基因奶山羊插入位点序列 | 第137-140页 |
| 2 试验结果 | 第140-149页 |
| ·PCR鉴定克隆奶山羊为转IGF-1基因奶山羊 | 第140-142页 |
| ·Southern-blot进一步确定克隆奶山羊为转IGF-1基因奶山羊 | 第142-143页 |
| ·荧光定量PCR鉴定转IGF-1基因奶山羊质粒插入拷贝数 | 第143-146页 |
| ·TAIL-PCR鉴定转转IGF-1基因奶山羊外源基因插入位点序列 | 第146-149页 |
| 3 讨论 | 第149-151页 |
| 参考文献 | 第151-153页 |
| 全文结论 | 第153-155页 |
| 本文创新点 | 第155-157页 |
| 论文发表情况 | 第157-159页 |
| 致谢 | 第159-160页 |
