| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-15页 |
| 第1章 绪论 | 第15-34页 |
| ·腈水解酶简介 | 第15-19页 |
| ·腈水解酶的应用 | 第19-24页 |
| ·光学纯扁桃酸的应用 | 第24页 |
| ·光学纯扁桃酸制备的研究现状 | 第24-25页 |
| ·羟腈裂解酶简介 | 第25-26页 |
| ·羟腈裂解酶的研究进展 | 第26-30页 |
| ·羟腈裂解酶的筛选 | 第28页 |
| ·羟腈裂解酶的理性设计和定向进化 | 第28-30页 |
| ·羟腈裂解酶在有机合成中大规模应用的实例 | 第30-32页 |
| ·本课题研究的目的和意义 | 第32-33页 |
| ·本课题研究的主要内容 | 第33-34页 |
| 第2章 产碱杆菌腈水解酶的克隆表达及纯化表征 | 第34-50页 |
| ·前言 | 第34页 |
| ·材料与方法 | 第34-40页 |
| ·主要试剂及仪器 | 第34-35页 |
| ·菌株及质粒载体 | 第35页 |
| ·培养基 | 第35页 |
| ·引物 | 第35-36页 |
| ·分析方法 | 第36-38页 |
| ·蛋白含量测定 | 第36页 |
| ·腈水解酶活力的测定 | 第36-37页 |
| ·液相色谱分析 | 第37-38页 |
| ·实验方法 | 第38-40页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第38页 |
| ·目的基因的PCR扩增 | 第38-39页 |
| ·重组质粒的构建 | 第39页 |
| ·目标蛋白的诱导表达 | 第39页 |
| ·目标蛋白的分离纯化 | 第39页 |
| ·温度和pH值对腈水解酶活力的影响 | 第39-40页 |
| ·金属离子对腈水解酶活力的影响 | 第40页 |
| ·腈水解酶的底物谱 | 第40页 |
| ·腈水解酶水解扁桃腈的动力学 | 第40页 |
| ·利用腈水解酶水解扁桃腈制备扁桃酸 | 第40页 |
| ·结果与讨论 | 第40-49页 |
| ·目标基因的扩增 | 第40-42页 |
| ·重组质粒的构建 | 第42页 |
| ·重组蛋白的诱导表达 | 第42-43页 |
| ·重组蛋白的分离纯化 | 第43-44页 |
| ·温度和pH值对腈水解酶活力的影响 | 第44-46页 |
| ·金属离子和EDTA对腈水解酶活力的影响 | 第46-47页 |
| ·腈水解酶的底物谱 | 第47-48页 |
| ·腈水解酶水解扁桃腈的动力学 | 第48页 |
| ·腈水解酶水解扁桃腈的反应进程 | 第48-49页 |
| ·本章小结 | 第49-50页 |
| 第3章 重组腈水解酶制备光学纯扁桃酸的过程研究 | 第50-61页 |
| ·前言 | 第50页 |
| ·材料与方法 | 第50-52页 |
| ·主要试剂及仪器 | 第50页 |
| ·菌种及培养基 | 第50-51页 |
| ·分析方法 | 第51页 |
| ·腈水解酶活力的测定 | 第51页 |
| ·液相色谱分析 | 第51页 |
| ·薄板层析分析 | 第51页 |
| ·旋光测定 | 第51页 |
| ·实验方法 | 第51-52页 |
| ·重组大肠杆菌的发酵培养 | 第51-52页 |
| ·温度和pH对重组整细胞活性的影响 | 第52页 |
| ·重组整细胞的底物耐受性 | 第52页 |
| ·批次补料制备光学纯扁桃酸 | 第52页 |
| ·重组整细胞的重复利用 | 第52页 |
| ·光学纯扁桃酸的克级制备 | 第52页 |
| ·结果与讨论 | 第52-59页 |
| ·温度对重组整细胞活力的影响 | 第52-53页 |
| ·pH对重组整细胞活力的影响 | 第53-54页 |
| ·重组整细胞的底物耐受性 | 第54-55页 |
| ·底物浓度对重组整细胞活力的影响 | 第55-56页 |
| ·苯甲醛对重组整细胞活力的影响 | 第56页 |
| ·重组整细胞在酸性环境中的稳定性 | 第56-57页 |
| ·产物抑制考察 | 第57-58页 |
| ·批次补料制备光学纯扁桃酸 | 第58页 |
| ·重组整细胞的操作稳定性 | 第58-59页 |
| ·光学纯扁桃酸的克级制备 | 第59页 |
| ·本章小结 | 第59-61页 |
| 第4章 两相体系中重组腈水解酶催化制备光学纯扁桃酸的研究 | 第61-72页 |
| ·前言 | 第61页 |
| ·材料与方法 | 第61-63页 |
| ·主要试剂及仪器 | 第62页 |
| ·菌种及培养基 | 第62页 |
| ·分析方法 | 第62页 |
| ·实验方法 | 第62-63页 |
| ·重组大肠杆菌的发酵培养 | 第62页 |
| ·整细胞在有机溶剂中耐受性的考察 | 第62页 |
| ·底物和产物在水-有机溶剂两相体系中的分配 | 第62页 |
| ·在水相和水-甲苯两相体系中水解扁桃腈和邻氯扁桃腈 | 第62-63页 |
| ·重组大肠杆菌固定化细胞的制备 | 第63页 |
| ·利用固定化细胞在两相体系中催化扁桃腈水解反应的放大 | 第63页 |
| ·结果与讨论 | 第63-71页 |
| ·有机溶剂耐受性考察 | 第63-64页 |
| ·扁桃酸和扁桃腈在水-有机溶剂两相体系中的分配 | 第64-65页 |
| ·两相体系中有机溶剂的含量对扁桃腈水解反应的影响 | 第65-66页 |
| ·温度和pH对两相体系中扁桃腈水解反应的影响 | 第66-67页 |
| ·在单水相和两相体系中进行扁桃腈的水解反应 | 第67-69页 |
| ·在水-甲苯两相体系中进行批次补料制备扁桃酸 | 第69-70页 |
| ·利用固定化细胞在两相体系中催化扁桃腈水解反应的放大 | 第70-71页 |
| ·本章小结 | 第71-72页 |
| 第5章 羟腈裂解酶的理性设计及其分子进化研究 | 第72-86页 |
| ·前言 | 第72-73页 |
| ·材料与方法 | 第73-77页 |
| ·主要试剂及仪器 | 第73页 |
| ·菌株及质粒 | 第73-74页 |
| ·培养基 | 第74页 |
| ·引物 | 第74-75页 |
| ·测序引物 | 第74页 |
| ·定点突变引物 | 第74-75页 |
| ·定点突变 | 第75页 |
| ·蛋白的表达与纯化 | 第75-76页 |
| ·SABP2突变体的表达与纯化 | 第75-76页 |
| ·HbHNL的表达与纯化 | 第76页 |
| ·蛋白含量的测定 | 第76页 |
| ·酶活检测 | 第76-77页 |
| ·羟腈裂解酶 | 第76-77页 |
| ·酯酶 | 第77页 |
| ·结果与讨论 | 第77-85页 |
| ·酯酶与羟腈裂解酶的结构比较与序列比对 | 第77-79页 |
| ·SABP2 G12T/M239K及其突变体的羟腈裂解酶活力 | 第79-80页 |
| ·SABP2 G12T/M239K及其突变体的动力学 | 第80页 |
| ·SABP2 G12T/M239K及其突变体的硝基醛缩酶活力 | 第80-81页 |
| ·SABP2 G12T/M239K及其突变体催化亨利反应的动力学 | 第81-82页 |
| ·由酯酶到羟腈裂解酶的进化途径研究 | 第82-85页 |
| ·由酯酶到羟腈裂解酶的可能进化途径 | 第82页 |
| ·SABP2单突变体的酯酶和羟腈裂解酶活力 | 第82-83页 |
| ·SABP2双突变体的酯酶和羟腈裂解酶活力 | 第83-84页 |
| ·SABP2三突变体的酯酶和羟腈裂解酶活力 | 第84-85页 |
| ·本章小结 | 第85-86页 |
| 第6章 酯酶/羟腈裂解酶祖先酶的构建及进化研究 | 第86-97页 |
| ·前言 | 第86-88页 |
| ·材料与方法 | 第88-90页 |
| ·主要试剂及仪器 | 第88页 |
| ·菌株及质粒 | 第88页 |
| ·培养基 | 第88页 |
| ·引物 | 第88-89页 |
| ·测序引物 | 第88-89页 |
| ·定点突变引物 | 第89页 |
| ·定点突变 | 第89页 |
| ·蛋白的表达与纯化 | 第89-90页 |
| ·蛋白含量的测定 | 第90页 |
| ·酶活力检测 | 第90页 |
| ·结果与讨论 | 第90-95页 |
| ·祖先酶的构建 | 第90页 |
| ·祖先酶的羟腈裂解酶和酯酶活力 | 第90-91页 |
| ·祖先酶的动力学 | 第91-92页 |
| ·祖先酶的硝基醛缩酶活力 | 第92页 |
| ·祖先酶的氨基酸序列分析 | 第92-94页 |
| ·祖先酶突变体的酯酶和羟腈裂解酶活力 | 第94-95页 |
| ·HNL4突变体的动力学 | 第95页 |
| ·羟腈裂解酶突变体的动力学 | 第95页 |
| ·酯酶突变体的动力学 | 第95页 |
| ·本章小结 | 第95-97页 |
| 第7章 总结与展望 | 第97-100页 |
| ·全文总结 | 第97-98页 |
| ·论文创新点 | 第98-99页 |
| ·工作展望 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-116页 |
| 攻读博士期间发表的论文及专利 | 第116-118页 |
| 致谢 | 第118-119页 |
| 附录 | 第119-126页 |
