| 摘要 | 第1-3页 |
| Abstract | 第3-4页 |
| 中文文摘 | 第4-10页 |
| 第1章 绪论 | 第10-38页 |
| ·理性设计 | 第11-16页 |
| ·寡核苷酸引物介导的定点突变 | 第11-13页 |
| ·寡核苷酸引物介导的定点突变方法的原理和方法 | 第11-12页 |
| ·改良的寡核苷酸引物所介导的定点突变方法 | 第12-13页 |
| ·PCR介导的定点突变 | 第13-16页 |
| ·重叠延伸PCR | 第14页 |
| ·大引物突变法 | 第14-15页 |
| ·盒式突变 | 第15-16页 |
| ·非理性设计——酶分子定向进化技术 | 第16-31页 |
| ·酶分子定向进化的历史 | 第16-17页 |
| ·酶分子定向进化的策略 | 第17-27页 |
| ·易错PCR技术 | 第17-18页 |
| ·DNA改组技术 | 第18-20页 |
| ·外显子改组 | 第20-21页 |
| ·交错延伸重组 | 第21-22页 |
| ·随机引物体外重组 | 第22-23页 |
| ·酶法体外随机-定位诱变 | 第23-24页 |
| ·合成改组 | 第24页 |
| ·截断状模板重组延伸 | 第24-25页 |
| ·退火低核苷酸基因重排 | 第25页 |
| ·非依赖序列同源性的重组法 | 第25-27页 |
| ·定向进化文库的筛选方法 | 第27-31页 |
| ·常规筛选方法 | 第27-29页 |
| ·新发展的高效筛选方法 | 第29-31页 |
| ·酶分子工程的应用和发展前景 | 第31-34页 |
| ·提高酶分子的催化活性 | 第31-32页 |
| ·提高酶分子稳定性 | 第32页 |
| ·微生物酶分子对底物的专一性的定向改造 | 第32-33页 |
| ·对映体选择性的定向进化 | 第33页 |
| ·对蛋白药物的改造 | 第33-34页 |
| ·本课题研究背景 | 第34-36页 |
| ·本课题研究内容和意义 | 第36-38页 |
| ·本课题研究内容 | 第36页 |
| ·本课题研究的目的和意义 | 第36-38页 |
| 第2章 棒状链霉菌扩环酶基因的定点突变 | 第38-56页 |
| ·前言 | 第38-39页 |
| ·材料与方法 | 第39-46页 |
| ·材料 | 第39-41页 |
| ·菌株和质粒 | 第39页 |
| ·试剂 | 第39-40页 |
| ·培养基以及缓冲液 | 第40页 |
| ·主要仪器 | 第40页 |
| ·定点突变引物 | 第40-41页 |
| ·方法 | 第41-46页 |
| ·大肠杆菌重组质粒pET30a-scDAOC的提取 | 第41-42页 |
| ·定点突变的PCR条件 | 第42-43页 |
| ·感受态E.coli JM109/E.coli BL21的制备 | 第43页 |
| ·PCR产物的热激转化 | 第43页 |
| ·阳性克隆子的快速筛选与验证 | 第43-44页 |
| ·野生型和突变体的表达转化 | 第44页 |
| ·突变体生物活性的检测 | 第44-46页 |
| ·结果与讨论 | 第46-55页 |
| ·定点突变的PCR条件的摸索 | 第46页 |
| ·阳性克隆子的快速筛选与验证 | 第46-47页 |
| ·突变体的测序验证 | 第47-49页 |
| ·野生型和突变体的SDS-PAGE检测 | 第49页 |
| ·标准蛋白曲线的绘制 | 第49-50页 |
| ·野生型和突变体的抑菌圈测定 | 第50-51页 |
| ·野生型和突变体的HPLC测定酶活 | 第51-55页 |
| ·小结 | 第55-56页 |
| 第3章 棒状链霉菌扩环酶基因随机突变的研究 | 第56-66页 |
| ·前言 | 第56页 |
| ·材料与方法 | 第56-61页 |
| ·材料 | 第56-58页 |
| ·菌株和质粒 | 第56-57页 |
| ·试剂 | 第57页 |
| ·培养基以及缓冲液 | 第57页 |
| ·主要仪器 | 第57-58页 |
| ·易错PCR和DNA改组的引物 | 第58页 |
| ·方法 | 第58-61页 |
| ·棒状链霉菌扩环酶基因的Error-prone PCR | 第58-60页 |
| ·DNA改组探索 | 第60-61页 |
| ·结果与讨论 | 第61-64页 |
| ·Error-prone PCR | 第61-63页 |
| ·Error-prone PCR条件优化 | 第61页 |
| ·菌落PCR验证阳性克隆子并测序分析 | 第61-62页 |
| ·易错PCR产物的表达转化以及酶切鉴定 | 第62页 |
| ·Error-prone PCR的突变基因库表达和酶活检测 | 第62-63页 |
| ·DNA改组探索 | 第63-64页 |
| ·链霉菌和真菌扩环酶摸板的大量扩增 | 第63页 |
| ·目的基因的随机片段化 | 第63页 |
| ·无引物PCR重组 | 第63-64页 |
| ·有引物PCR | 第64页 |
| ·PCR产物的测序验证 | 第64页 |
| ·小结 | 第64-66页 |
| 第4章 耐热脂肪酶产生菌FS1403的分离筛选和16SrDNA基因序列的分析 | 第66-76页 |
| ·前言 | 第66页 |
| ·材料与方法 | 第66-70页 |
| ·材料 | 第66-67页 |
| ·菌株和质粒 | 第66页 |
| ·试剂 | 第66页 |
| ·培养基 | 第66-67页 |
| ·仪器 | 第67页 |
| ·引物 | 第67页 |
| ·方法 | 第67-70页 |
| ·嗜热菌的分离培养 | 第67页 |
| ·产脂肪酶耐热菌株的筛选 | 第67页 |
| ·产脂肪酶菌株耐热性试验 | 第67页 |
| ·FS1403脂肪酶性质的初步研究 | 第67-68页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第68-69页 |
| ·16SrDNA基因获得 | 第69页 |
| ·16SrDNA基因的连接转化 | 第69页 |
| ·16SrDNA基因阳性克隆子的菌落PCR鉴定 | 第69页 |
| ·16SrDNA序列分析和进化树构建 | 第69-70页 |
| ·结果与讨论 | 第70-74页 |
| ·产脂肪酶耐热菌株的筛选 | 第70页 |
| ·FS1403脂肪酶性质的初步研究 | 第70-71页 |
| ·FS1403脂肪酶活性测定 | 第70页 |
| ·FS1403脂肪酶作用温度和作用pH | 第70-71页 |
| ·温度对FS1403脂肪酶热稳定性的影响 | 第71页 |
| ·FS1403基因组DNA的提取 | 第71-72页 |
| ·FS1403 16SrDNA基因获得 | 第72页 |
| ·FS1403 16SrDNA基因阳性克隆子的筛选与验证 | 第72-73页 |
| ·FS1403 16SrDNA基因测序结果 | 第73页 |
| ·FS1403 16SrDNA基因系统进化树分析 | 第73-74页 |
| ·小结 | 第74-76页 |
| 第5章 Bacillus subtilis FS1403耐热脂肪酶基因的克隆和表达 | 第76-90页 |
| ·前言 | 第76页 |
| ·材料和方法 | 第76-82页 |
| ·材料 | 第76-78页 |
| ·菌株和质粒 | 第76页 |
| ·工具酶和生化试剂 | 第76-77页 |
| ·培养基及缓冲液 | 第77页 |
| ·引物 | 第77-78页 |
| ·主要仪器设备 | 第78页 |
| ·方法 | 第78-82页 |
| ·菌株基因组DNA的提取 | 第78-79页 |
| ·脂肪酶基因的获得 | 第79页 |
| ·脂肪酶基因的回收 | 第79页 |
| ·CaCl_2法制备宿主菌E.coli JM109、E.coli BL21感受态细胞 | 第79页 |
| ·脂肪酶基因的克隆 | 第79页 |
| ·脂肪酶基因阳性克隆子的菌落PCR鉴定 | 第79-80页 |
| ·脂肪酶基因序列的测定 | 第80页 |
| ·重组表达质粒的构建及鉴定 | 第80-81页 |
| ·脂肪酶基因在原核表达载体中的表达 | 第81页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE分析 | 第81页 |
| ·重组枯草芽孢杆菌耐热脂肪酶酶学性质的初步研究 | 第81-82页 |
| ·结果与讨论 | 第82-88页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第82页 |
| ·目的基因PCR扩增 | 第82-83页 |
| ·克隆与重组子的鉴定 | 第83页 |
| ·脂肪酶基因的测序结果 | 第83-84页 |
| ·脂肪酶序列的结构分析 | 第84-85页 |
| ·基因序列的分析 | 第84页 |
| ·编码蛋白的预测及分析 | 第84-85页 |
| ·原核表达载体的构建与鉴定 | 第85页 |
| ·表达产物的电泳结果 | 第85-86页 |
| ·重组芽孢杆菌耐热脂肪酶酶学性质的初步鉴定 | 第86-88页 |
| ·重组菌脂肪酶的活性鉴定 | 第86页 |
| ·温度对重组菌表达的脂肪酶的酶活的影响 | 第86-87页 |
| ·pH对重组菌表达的脂肪酶的酶活的影响 | 第87页 |
| ·温度对重组菌脂肪酶热稳定性的影响 | 第87-88页 |
| ·小结 | 第88-90页 |
| 总结与展望 | 第90-92页 |
| 附录 主要符号对照表 | 第92-94页 |
| 参考文献 | 第94-100页 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 | 第100-102页 |
| 致谢 | 第102-104页 |
| 个人简历 | 第104-105页 |
