| 中文摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-23页 |
| ·薤白简介 | 第11页 |
| ·草甘膦 | 第11-12页 |
| ·EPSP合酶及其编码基因的研究进展 | 第12-23页 |
| 第二章 薤白EPSP合成酶基因的克隆及序列分析 | 第23-54页 |
| 1 材料与试剂 | 第23页 |
| ·植物材料 | 第23页 |
| ·菌株 | 第23页 |
| ·酶与试剂盒 | 第23页 |
| ·试剂 | 第23页 |
| 2 实验方法 | 第23-38页 |
| ·薤白RNA的提取及RNA质量检测 | 第23-25页 |
| ·薤白EPSP合成酶基因中间保守片段的获得 | 第25-30页 |
| ·3′RACE获得cDNA 3′端序列 | 第30-32页 |
| ·5′RACE获得cDNA 5′端序列 | 第32-34页 |
| ·5′RACE获得cDNA 5′端完整序列 | 第34-37页 |
| ·EPSPs全序列的获得 | 第37-38页 |
| ·薤白EPSP合酶基因序列的生物信息学分析 | 第38页 |
| 3 实验结果与分析 | 第38-51页 |
| ·薤白总RNA提取 | 第38页 |
| ·EPSPsA基因中间片段的克隆 | 第38-39页 |
| ·EPSPsA基因3′端序列的克隆 | 第39-40页 |
| ·EPSPsA基因5′端部分序列的克隆 | 第40-41页 |
| ·EPSPsA基因5′端全序列的克隆 | 第41页 |
| ·序列分析 | 第41-51页 |
| 4 讨论 | 第51-54页 |
| ·关于RACE技术 | 第51-52页 |
| ·对于ROCHE公司5′RACE技术的探讨 | 第52页 |
| ·对于Clontech公司5′RACE技术的探讨 | 第52-54页 |
| 第三章 EPSPsA基因不同组织表达的半定量分析 | 第54-66页 |
| 1 材料与试剂 | 第54页 |
| ·酶与试剂 | 第54页 |
| 2 实验方法 | 第54-58页 |
| ·不同组织总RNA的提取 | 第54-55页 |
| ·薤白cDNA第一链的合成 | 第55页 |
| ·半定量RT-PCR表达分析引物设计 | 第55页 |
| ·最佳反应条件的优化 | 第55-57页 |
| ·数据分析 | 第57-58页 |
| 3 结果与分析 | 第58-64页 |
| ·不同组织RNA提取结果 | 第58页 |
| ·PCR扩增体系的优化 | 第58页 |
| ·EP-1、EP-2引物反应条件优化结果 | 第58-60页 |
| ·循环数对平台期的影响 | 第60-62页 |
| ·对薤白EPSPsA基因在不同组织表达定量的结果 | 第62-64页 |
| 4 讨论 | 第64-66页 |
| ·关于半定量RT-PCR | 第64-65页 |
| ·关于EPSPsA基因的表达 | 第65-66页 |
| 第四章 EPSPsA在大肠杆菌中的表达与分析 | 第66-81页 |
| 1 材料与试剂 | 第66页 |
| ·菌株与质粒 | 第66页 |
| ·工具酶及主要试剂 | 第66页 |
| ·试剂 | 第66页 |
| 2 实验方法 | 第66-70页 |
| ·引物设计及目的基因的PCR扩增 | 第66-67页 |
| ·融合表达载体pMAL-p2X-EPSPsA的构建及检测 | 第67-70页 |
| ·草甘膦处理 | 第70页 |
| 3 pRSET-A-EPSPs的构建及鉴定 | 第70-73页 |
| ·引物设计及目的基因的PCR扩增 | 第70-71页 |
| ·融合表达载体pRSET-A-EPSPs的构建及检测 | 第71-73页 |
| 4 结果与分析 | 第73-79页 |
| ·表达载体pMAL-p2X-EPSPsA的构建流程 | 第73-74页 |
| ·EPSPsA目的基因与pMAL-p2X载体双酶切结果 | 第74页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE分析 | 第74-75页 |
| ·草甘膦处理结果分析 | 第75-76页 |
| ·表达载体pRSET-A-EPSPs的构建流程 | 第76页 |
| ·EPSPs目的基因与pRSET-A载体双酶切结果 | 第76-77页 |
| ·表达载体pRSET-A—EPSPs的菌落PCR及双酶切检测 | 第77-78页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE分析 | 第78页 |
| ·草甘膦处理结果分析 | 第78-79页 |
| ·草甘处理结果对比分析 | 第79页 |
| 5 讨论 | 第79-81页 |
| ·关于pMAL-p2X | 第79-80页 |
| ·关于pRSET-A | 第80-81页 |
| 第五章 EPSPsA基因植物载体的构建及对烟草的转化 | 第81-93页 |
| 1 材料与试剂 | 第81-82页 |
| ·菌株与质粒 | 第81页 |
| ·植物材料及培养基 | 第81-82页 |
| ·酶与试剂盒 | 第82页 |
| ·试剂 | 第82页 |
| 2 实验方法 | 第82-86页 |
| ·引物设计及基因的PCR扩增 | 第82-83页 |
| ·过表达载体pWM-EPSPsA的构建及检测 | 第83-84页 |
| ·过表达载体pWM-EPSPsA转化根癌农杆菌 | 第84-85页 |
| ·叶盘法转化烟草 | 第85-86页 |
| ·转基因烟草的草甘膦抗性检测 | 第86页 |
| 3 结果与分析 | 第86-91页 |
| ·正义植物表达载体pWM101-EPSPsA的构建流程 | 第86-87页 |
| ·EPSPs基因PCR扩增结果 | 第87-88页 |
| ·表达载体pWM101-EPSPsA的检测 | 第88页 |
| ·表达载体pWM101-EPSPsA转化农杆菌LBA4404的检测 | 第88-89页 |
| ·叶盘法转化烟草 | 第89-90页 |
| ·烟草愈伤对草甘膦抗性的检测结果 | 第90-91页 |
| 4 讨论 | 第91-93页 |
| ·叶盘法转化烟草 | 第91页 |
| ·诱导丛生芽 | 第91-92页 |
| ·草甘膦的抗性筛选 | 第92-93页 |
| 第六章 结论 | 第93-94页 |
| 参考文献 | 第94-98页 |
| 附录A EPSPsA基因中间片段测序报告 | 第98-99页 |
| 附录B EPSPsA基因3末端片段测序报告 | 第99-100页 |
| 附录C EPSPsA基因5末端部分片段测序报告 | 第100-101页 |
| 附录D EPSPsA基因5末端完整片段测序报告 | 第101-102页 |
| 附录E EPSPsA基因全测序报告 | 第102-104页 |
| 附录F 附缩略词表 | 第104-106页 |
| 附录G 主要试剂配置 | 第106-109页 |
| 附录H EPSPsA基因登陆GenBank | 第109-111页 |
| 附录I 载体图谱 | 第111-113页 |
| 致谢 | 第113-114页 |
| 作者简历 | 第114页 |
