| 目录 | 第1-11页 |
| 中文摘要 | 第11-12页 |
| ABSTRACT | 第12-13页 |
| 英文缩写表 | 第13-14页 |
| 前言 | 第14-22页 |
| 1 PQQ的生物合成基因 | 第15-16页 |
| 2 PQQ合成基因功能的研究 | 第16-18页 |
| 3 PQQ的生物合成途径研究 | 第18-22页 |
| 第一章 大肠杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆 | 第22-29页 |
| 1 材料 | 第22-23页 |
| ·菌种与质粒 | 第22页 |
| ·培养基 | 第22页 |
| ·试剂 | 第22页 |
| ·主要溶液 | 第22页 |
| ·主要仪器 | 第22-23页 |
| ·PCR引物 | 第23页 |
| 2 方法 | 第23-25页 |
| ·大肠杆菌基因组的制备 | 第23页 |
| ·葡萄糖脱氢酶基因PCR扩增 | 第23-24页 |
| ·DNA片段的纯化 | 第24页 |
| ·表达载体pET28a的制备 | 第24页 |
| ·外源DNA与质粒载体的连接反应 | 第24页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 | 第24-25页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第24页 |
| ·连接产物的转化反应 | 第24-25页 |
| ·阳性克隆重组子的筛选鉴定 | 第25页 |
| ·DNA序列的测定 | 第25页 |
| ·序列分析 | 第25页 |
| 3 结果 | 第25-28页 |
| ·葡萄糖脱氢酶基因的PCR扩增 | 第25-26页 |
| ·重组质粒pET28a-GDH的构建 | 第26-27页 |
| ·重组质粒pET28a-GDH的鉴定 | 第27页 |
| ·重组质粒的测序结果 | 第27-28页 |
| 4 讨论 | 第28-29页 |
| 第二章 葡萄糖脱氢酶表达纯化与活性分析 | 第29-34页 |
| 1 材料 | 第29-30页 |
| ·菌种和质粒 | 第29页 |
| ·培养基 | 第29页 |
| ·试剂 | 第29页 |
| ·主要溶液 | 第29-30页 |
| ·主要仪器 | 第30页 |
| 2 方法 | 第30-31页 |
| ·诱导表达 | 第30页 |
| ·表达产物SDS-PAGE分析 | 第30页 |
| ·菌体蛋白含量的测定 | 第30-31页 |
| 3 结果 | 第31-33页 |
| ·葡萄糖脱氢酶的诱导表达 | 第31页 |
| ·葡萄糖脱氢酶的纯化 | 第31-32页 |
| ·蛋白含量测定 | 第32页 |
| ·葡萄糖脱氢酶的活性检测 | 第32-33页 |
| 4 讨论 | 第33-34页 |
| 第三章 吡咯喹啉醌产生菌的筛选 | 第34-42页 |
| 1 材料 | 第34-35页 |
| ·土壤样本 | 第34页 |
| ·培养基 | 第34页 |
| ·试剂 | 第34页 |
| ·主要溶液 | 第34页 |
| ·主要仪器 | 第34-35页 |
| ·PCR引物 | 第35页 |
| 2 方法 | 第35-36页 |
| ·土样采集 | 第35页 |
| ·MP606基因组的提取 | 第35页 |
| ·MP606 16S rDNA的扩增 | 第35页 |
| ·16S rDNA序列的分析 | 第35-36页 |
| 3 结果 | 第36-40页 |
| ·PQQ检测方法的建立 | 第36页 |
| ·反应原理 | 第36页 |
| ·操作过程 | 第36页 |
| ·甲基营养菌筛选模型的建立 | 第36-37页 |
| ·菌种筛选 | 第37页 |
| ·16S rDNA序列的扩增 | 第37-38页 |
| ·16S rDNA序列的分析 | 第38-40页 |
| ·碳源利用的考察 | 第40页 |
| 4 讨论 | 第40-42页 |
| 第四章 吡咯喹啉醌的制备与鉴定 | 第42-49页 |
| 1 材料 | 第42-43页 |
| ·菌种 | 第42页 |
| ·培养基 | 第42页 |
| ·试剂 | 第42页 |
| ·主要溶液 | 第42页 |
| ·主要仪器 | 第42-43页 |
| 2 方法 | 第43-44页 |
| ·菌种培养 | 第43页 |
| ·产物的制备 | 第43页 |
| ·产物的分析 | 第43-44页 |
| ·产物的HPLC分析 | 第43页 |
| ·产物的重组酶法分析 | 第43-44页 |
| 3 结果 | 第44-48页 |
| ·产物的获得 | 第44-45页 |
| ·产物的分析鉴定 | 第45-47页 |
| ·菌体的发酵罐培养 | 第47-48页 |
| 4 讨论 | 第48-49页 |
| 第五章 吡咯喹啉醌产生菌基因操作系统初步研究 | 第49-54页 |
| 1 材料 | 第49页 |
| ·菌种和质粒 | 第49页 |
| ·培养基 | 第49页 |
| ·工具酶及试剂盒 | 第49页 |
| ·试剂 | 第49页 |
| ·主要仪器 | 第49页 |
| 2 方法 | 第49-50页 |
| ·质粒的接合转移 | 第49-50页 |
| ·大肠杆菌合成PQQ的检测方法 | 第50页 |
| 3 结果 | 第50-53页 |
| ·MP606合适载体的确定 | 第50-51页 |
| ·pBBR1MSC2-PQQ质粒的构建 | 第51-52页 |
| ·pBBR1MCS2-PQQ的鉴定 | 第52页 |
| ·重组质粒pBBR1MCS2-PQQ的接合转移及回转验证 | 第52-53页 |
| ·MP606的Tn5诱变 | 第53页 |
| 4 讨论 | 第53-54页 |
| 第六章 大肠杆菌PQQ合成相关基因的研究 | 第54-65页 |
| 1 材料 | 第55-56页 |
| ·菌种和质粒 | 第55页 |
| ·培养基 | 第55页 |
| ·试剂 | 第55-56页 |
| ·主要溶液 | 第56页 |
| ·主要仪器 | 第56页 |
| ·PCR引物 | 第56页 |
| 2 方法 | 第56-58页 |
| ·大肠杆菌基因组的提取 | 第56页 |
| ·ptsI基因和庆大霉素抗性基因的扩增 | 第56-57页 |
| ·克雷伯氏菌pqq A-E的扩增 | 第57页 |
| ·用于Red重组的大肠杆菌电转化感受态细胞的制备 | 第57-58页 |
| ·电转化 | 第58页 |
| ·大肠杆菌葡萄糖脱氢酶全基因的扩增 | 第58页 |
| 3 结果 | 第58-64页 |
| ·pUC19-ptsI-Gm质粒的构建 | 第58-61页 |
| ·ptsI基因的敲除 | 第61页 |
| ·大肠杆菌ptsI突变体的验证 | 第61页 |
| ·转座载体pUT-Tn5-Gm的构建 | 第61-63页 |
| ·表达质粒pUC19-GDH pUCM-GDH的构建 | 第63页 |
| ·大肠杆菌的Tn5诱变 | 第63-64页 |
| ·大肠杆菌中pqqF、pqqG类似基因的研究 | 第64页 |
| 4 讨论 | 第64-65页 |
| 结论 | 第65-66页 |
| 讨论 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-71页 |
| 发表文章目录 | 第71-72页 |
| 致谢 | 第72页 |