| 摘要 | 第1-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 缩写 | 第10-11页 |
| 第1章 绪论 | 第11-32页 |
| ·重要的蒽环类抗生素——柔红霉素和阿霉素概述 | 第11-13页 |
| ·柔红霉素和阿霉素分子结构及性质 | 第11-12页 |
| ·柔红霉素和阿霉素作用机理及用途 | 第12页 |
| ·市场前景 | 第12-13页 |
| ·阿霉素的合成方法 | 第13-18页 |
| ·阿霉素的化学合成 | 第13-14页 |
| ·阿霉素的生物合成 | 第14-18页 |
| ·阿霉素生物合成的必要条件 | 第18-24页 |
| ·外源基因doxA的特点(P450酶) | 第18-19页 |
| ·链霉菌表达系统 | 第19-22页 |
| ·宿主耐受DNR和DXR的抗性机制 | 第22-23页 |
| ·异源表达宿主系统 | 第23-24页 |
| ·同源重组与基因交换 | 第24-27页 |
| ·同源重组 | 第24-25页 |
| ·基因交换 | 第25-27页 |
| ·微生物转化及辅因子再生系统 | 第27-31页 |
| ·微生物转化的特点 | 第27-28页 |
| ·辅因子再生系统 | 第28页 |
| ·微生物转化过程中的辅因子再生策略 | 第28-30页 |
| ·辅因子再生实例 | 第30-31页 |
| ·本课题的立题意义和研究内容 | 第31-32页 |
| 第2章 doxA基因在大肠杆菌中的克隆、融合表达及酶的纯化 | 第32-45页 |
| ·实验材料 | 第32-35页 |
| ·菌种和质粒 | 第32-33页 |
| ·培养基 | 第33页 |
| ·试剂与缓冲液的配制 | 第33-35页 |
| ·主要仪器和设备 | 第35页 |
| ·实验方法 | 第35-39页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞制备 | 第35-36页 |
| ·大肠杆菌质粒转化(CaCl_2法) | 第36页 |
| ·大肠杆菌质粒提取 | 第36-37页 |
| ·DNA片段的回收 | 第37页 |
| ·重组大肠杆菌培养条件 | 第37页 |
| ·亲和层析 | 第37页 |
| ·SDS-PAGE蛋白电泳 | 第37-38页 |
| ·Western blotting | 第38页 |
| ·菠菜样品处理 | 第38-39页 |
| ·酶活反应体系 | 第39页 |
| ·结果 | 第39-43页 |
| ·高效表达载体pYG914的构建 | 第39-40页 |
| ·重组蛋白的表达 | 第40-41页 |
| ·重组蛋白的验证 | 第41-42页 |
| ·重组蛋白包涵体的复性和纯化 | 第42-43页 |
| ·实验讨论 | 第43-44页 |
| ·小结 | 第44-45页 |
| 第3章 doxA基因在链霉菌表达系统中的表达及发酵产物的研究 | 第45-80页 |
| ·实验材料 | 第45-51页 |
| ·菌种和质粒 | 第45-47页 |
| ·培养基 | 第47-48页 |
| ·主要溶液和缓冲液 | 第48-49页 |
| ·试剂 | 第49-51页 |
| ·主要仪器和设备 | 第51页 |
| ·实验方法 | 第51-56页 |
| ·菌种的培养和保藏 | 第51-52页 |
| ·链霉菌基因组DNA的提取 | 第52页 |
| ·小片段tipA的回收 | 第52页 |
| ·链霉菌原生质体制备 | 第52-53页 |
| ·链霉菌质粒转化 | 第53页 |
| ·链霉菌质粒提取 | 第53-54页 |
| ·变铅青链霉菌的培养和菌丝体破碎 | 第54-55页 |
| ·CO结合差光谱分析 | 第55页 |
| ·重组菌发酵实验 | 第55页 |
| ·HPLC分析条件 | 第55-56页 |
| ·实验结果 | 第56-76页 |
| ·doxA基因及snpR+snpA的PCR扩增及序列测定 | 第56-64页 |
| ·启动子为snpA的表达质粒pYG908的构建 | 第64-66页 |
| ·启动子为tipA的表达质粒pYG915的构建 | 第66-67页 |
| ·启动子为ermEp~*的doxA基因表达质粒的构建 | 第67-69页 |
| ·重组菌蛋白表达 | 第69-70页 |
| ·重组菌蛋白的CO吸收实验 | 第70-71页 |
| ·重组菌对柔红霉素的转化 | 第71-73页 |
| ·阿霉素浓度标准曲线 | 第73页 |
| ·重组菌转化条件的研究 | 第73-76页 |
| ·实验讨论 | 第76-78页 |
| ·小结 | 第78-80页 |
| 第4章 柔红霉素抗性基因drrC在链霉菌中的克隆、表达 | 第80-89页 |
| ·实验材料 | 第81页 |
| ·菌种和质粒 | 第81页 |
| ·培养基和试剂 | 第81页 |
| ·实验方法 | 第81-82页 |
| ·链霉菌基因组DNA小量提取 | 第81-82页 |
| ·出发菌株TK24对DNR的最高耐受浓度 | 第82页 |
| ·实验结果 | 第82-87页 |
| ·TK24对柔红霉素的抗性实验 | 第82页 |
| ·扩增drrC的引物序列 | 第82-83页 |
| ·PCR扩增drrC | 第83-84页 |
| ·重组质粒的构建 | 第84-85页 |
| ·TK24(pYG937)对柔红霉素的耐受程度 | 第85-86页 |
| ·发酵产物的研究 | 第86-87页 |
| ·实验讨论 | 第87-88页 |
| ·小结 | 第88-89页 |
| 第5章 天蓝淡红链霉菌SIPI-1482中酮还原酶基因dauU的敲除及发酵产物的研究 | 第89-102页 |
| ·材料和方法 | 第90-92页 |
| ·材料 | 第90-92页 |
| ·方法 | 第92页 |
| ·结果 | 第92-99页 |
| ·dnrV+dauU+dauA(g)的PCR扩增 | 第92页 |
| ·重组质粒pYG926的构建 | 第92-93页 |
| ·重组质粒pYG926的酶切验证 | 第93-94页 |
| ·dauU基因的测序 | 第94-96页 |
| ·同源重组 | 第96页 |
| ·敲除菌的验证 | 第96-98页 |
| ·发酵产物的研究 | 第98-99页 |
| ·讨论 | 第99-100页 |
| ·小结 | 第100-102页 |
| 结论与创新点 | 第102-104页 |
| 参考文献 | 第104-108页 |
| 致谢 | 第108-109页 |
| 综述报告和发表文章 | 第109-110页 |
| 附录 | 第110-119页 |
