| 摘要 | 第1-11页 |
| ABSTRACT | 第11-14页 |
| 缩略语表 | 第14-15页 |
| 第1章 文献综述 | 第15-49页 |
| ·猪圆环病毒及其相关疾病研究进展 | 第15-46页 |
| ·病毒的发现 | 第15-16页 |
| ·病毒的理化特性 | 第16页 |
| ·病毒的增殖特性 | 第16-17页 |
| ·病毒的分子生物学研究进展 | 第17-27页 |
| ·PCV基因组结构 | 第17-18页 |
| ·PCV复制模式研究 | 第18-21页 |
| ·PCV转录模式研究 | 第21-24页 |
| ·ORF2基因研究进展 | 第24-27页 |
| ·PCV的流行病学 | 第27-29页 |
| ·PCV1的流行病学 | 第27-28页 |
| ·PCV2的流行病学 | 第28-29页 |
| ·与PCV2有关的疾病 | 第29-35页 |
| ·猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS) | 第29-31页 |
| ·猪皮炎／肾病综合征(PDNS) | 第31-32页 |
| ·PCV2相关性繁殖障碍 | 第32-33页 |
| ·猪呼吸道病复合症(PRDC) | 第33-34页 |
| ·先天性震颤及中枢神经系统疾病 | 第34-35页 |
| ·PCV2的致病机理 | 第35-40页 |
| ·免疫刺激 | 第36-37页 |
| ·免疫抑制 | 第37-40页 |
| ·诊断方法研究 | 第40-42页 |
| ·病原学方法 | 第40-41页 |
| ·血清学方法 | 第41-42页 |
| ·PCV2相关疾病的防制 | 第42-43页 |
| ·PCV2相关疾病的疫苗研究 | 第43-44页 |
| ·PMWS动物模型的研究 | 第44-46页 |
| ·GN猪动物模型的研究 | 第44-45页 |
| ·CD猪动物模型的研究 | 第45页 |
| ·CF猪动物模型的研究 | 第45-46页 |
| ·潜在的公共卫生学意义 | 第46页 |
| ·伪狂犬病病毒作为动物病毒疫苗活载体的研究 | 第46-49页 |
| ·动物病毒作为疫苗活载体的优越性及其特点 | 第46-47页 |
| ·伪狂犬病病毒概述 | 第47-48页 |
| ·伪狂犬病病毒作为活病毒载体的可行性及应用前景 | 第48-49页 |
| 第2章 研究目的和意义 | 第49-51页 |
| 第3章 材料与方法 | 第51-71页 |
| ·实验材料 | 第51-58页 |
| ·毒株与细胞 | 第51页 |
| ·菌种与质粒 | 第51-54页 |
| ·本研究中所用的寡核苷酸引物 | 第54页 |
| ·主要药品及试剂 | 第54页 |
| ·主要培养基 | 第54-55页 |
| ·血清 | 第55页 |
| ·缓冲液 | 第55-58页 |
| ·质粒提取用缓冲液 | 第55页 |
| ·SDS-PAGE缓冲液 | 第55-56页 |
| ·Western blotting缓冲液 | 第56页 |
| ·GST融合蛋白纯化缓冲液 | 第56页 |
| ·ELISA缓冲液 | 第56-57页 |
| ·Southern blotting缓冲液 | 第57页 |
| ·其它缓冲液 | 第57-58页 |
| ·实验动物 | 第58页 |
| ·实验方法 | 第58-71页 |
| ·病毒的增殖 | 第58页 |
| ·PCV2的增殖 | 第58页 |
| ·PRV的增殖 | 第58页 |
| ·PRV病毒基因组的提取 | 第58页 |
| ·PCR扩增与检测 | 第58-60页 |
| ·构建表达质粒用ORF2全基因的PCR扩增与检测 | 第58-59页 |
| ·构建转移质粒用ORF2全基因的PCR扩增与检测 | 第59页 |
| ·截去核定位序列的ORF2基因的PCR扩增与检测 | 第59-60页 |
| ·ORF1全基因的PCR扩增与检测 | 第60页 |
| ·PCR产物的回收与纯化 | 第60页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第60-61页 |
| ·连接产物的转化 | 第61页 |
| ·重组质粒的PCR快速鉴定 | 第61页 |
| ·质粒的制备 | 第61-62页 |
| ·质粒的小量制备 | 第61页 |
| ·质粒的大量制备 | 第61-62页 |
| ·重组细菌的诱导表达 | 第62页 |
| ·重组蛋白包涵体的提取 | 第62-63页 |
| ·用于SDS-PAGE电泳的包涵体提取 | 第62-63页 |
| ·用于ELISA包被抗原的包涵体的提取 | 第63页 |
| ·可溶性GST融合蛋白的纯化 | 第63-64页 |
| ·表达GST融合蛋白的重组细菌的诱导表达 | 第63页 |
| ·50％谷胱苷肽琼脂糖凝胶悬液的制备 | 第63页 |
| ·可溶性GST融合蛋白的纯化 | 第63-64页 |
| ·PCV2 ELISA方法的建立 | 第64-65页 |
| ·PCV2 ELISA抗原最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定 | 第64页 |
| ·PCV2 ELISA操作步骤 | 第64页 |
| ·PCV2 ELISA阴阳性界限的确定 | 第64页 |
| ·特异性试验 | 第64页 |
| ·重复性试验 | 第64-65页 |
| ·稳定性和保存期试验 | 第65页 |
| ·PCV2 ELISA与间接免疫荧光抗体检测试剂盒的比较试验 | 第65页 |
| ·共转染 | 第65页 |
| ·空斑筛选纯化 | 第65-66页 |
| ·PCR检测外源基因在重组病毒中的整合 | 第66页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第66页 |
| ·Western blotting | 第66-67页 |
| ·间接免疫荧光试验 | 第67页 |
| ·Southern blotting | 第67-68页 |
| ·探针的制备 | 第67页 |
| ·转印 | 第67-68页 |
| ·转印膜的干燥与固定 | 第68页 |
| ·预杂交和杂交 | 第68页 |
| ·洗膜 | 第68页 |
| ·免疫检测 | 第68页 |
| ·重组病毒的增殖及二价基因工程疫苗的制备 | 第68-69页 |
| ·二价基因工程疫苗的动物试验 | 第69页 |
| ·病毒TCID_(50)的测定 | 第69页 |
| ·病毒微量中和试验 | 第69页 |
| ·细胞免疫的检测 | 第69-71页 |
| ·外周血单核细胞的分离 | 第69-70页 |
| ·淋巴细胞增殖反应试验 | 第70-71页 |
| 第4章 结果与分析 | 第71-103页 |
| ·猪2型圆环病毒ORF2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 | 第71-76页 |
| ·PCV2 ORF2基因的PCR扩增 | 第71页 |
| ·PCV2 ORF2基因PCR产物的克隆与鉴定 | 第71页 |
| ·GST-ORF2融合表达的原核表达质粒的构建与酶切鉴定 | 第71-73页 |
| ·GST-ORF2融合蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第73-74页 |
| ·GST-ORF2融合蛋白的Western blotting分析 | 第74页 |
| ·GST-ORF2融合蛋白在细菌裂解液中的分布 | 第74页 |
| ·GST-ORF2融合蛋白包涵体的提取与纯化 | 第74-75页 |
| ·细菌裂解液上清中GST-ORF2融合蛋白的纯化 | 第75-76页 |
| ·猪2型圆环病毒ELISA诊断方法的建立及应用 | 第76-85页 |
| ·GST-ORF2包涵体蛋白及可溶性蛋白浓度的测定 | 第76页 |
| ·ELISA抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定 | 第76-81页 |
| ·GST-ORF2包涵体蛋白最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定 | 第76-78页 |
| ·GST-ORF2可溶性蛋白最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定 | 第78-81页 |
| ·PCV2 ELISA阴阳性界限的确定 | 第81页 |
| ·PCV2 ELISA方法的特异性试验 | 第81-82页 |
| ·PCV2 ELISA方法的重复性试验 | 第82-83页 |
| ·批内重复性试验 | 第82页 |
| ·批间重复性试验 | 第82-83页 |
| ·PCV2 ELISA方法的稳定性和抗原的保存期试验 | 第83-84页 |
| ·PCV2 ELISA与间接免疫荧光检测方法(IIF)的比较 | 第84页 |
| ·PCV2 ELISA方法的临床应用 | 第84-85页 |
| ·表达PCV2 ORF2基因的重组伪狂犬病病毒的构建 | 第85-90页 |
| ·表达PCV2 ORF2基因的重组伪狂犬病病毒构建的策略 | 第85页 |
| ·表达PCV2 ORF2基因的重组伪狂犬病病毒的结构 | 第85-86页 |
| ·PCV2 ORF2基因的PCR扩增 | 第86页 |
| ·重组转移质粒pgGORF2的构建与鉴定 | 第86-87页 |
| ·重组病毒TK~-／gG~-／ORF2~+的筛选与纯化 | 第87-88页 |
| ·重组病毒TK~-／gG~-／ORF2~+的PCR鉴定 | 第88-89页 |
| ·重组病毒TK~-／gG~-／ORF2~+的Southern blotting鉴定 | 第89页 |
| ·重组病毒TK~-／gG~-／ORF2~+中ORF2基因的表达检测 | 第89-90页 |
| ·表达PCV2 ORF1和ORF2基因的重组伪狂犬病病毒的构建 | 第90-96页 |
| ·表达PCV2 ORF1和ORF2基因的重组伪狂犬病病毒构建的策略 | 第90-91页 |
| ·表达PCV2 ORF1和ORF2基因的重组伪狂犬病病毒的结构 | 第91页 |
| ·PCV2 ORF1和ORF2基因的PCR扩增 | 第91-92页 |
| ·重组转移质粒pIEORF1ORF2的构建与鉴定 | 第92-93页 |
| ·重组病毒TK~-／gE~-／gI~-／ORF1-ORF2~+的筛选与纯化 | 第93页 |
| ·重组病毒TK~-／gE~-／gI~-／ORF1-ORF2~+的PCR鉴定 | 第93-94页 |
| ·重组病毒TK~-／gE~-／gI~-／ORF1-ORF2~+的Southern blotting鉴定 | 第94-96页 |
| ·重组病毒TK~-／gE~-／gI~-／ORF1-ORF2~+中融合蛋白的表达检测 | 第96页 |
| ·重组病毒的遗传稳定性 | 第96页 |
| ·外源基因的插入对重组病毒在细胞上增殖滴度的影响 | 第96-97页 |
| ·二价基因工程疫苗的制备 | 第97页 |
| ·二价基因工程疫苗的小鼠动物试验 | 第97-100页 |
| ·伪狂犬病病毒的中和抗体水平检测 | 第97-99页 |
| ·PCV2 ELISA抗体水平检测 | 第99页 |
| ·疫苗免疫小鼠对伪狂犬病病毒的攻毒保护效果 | 第99-100页 |
| ·TK~-／GE~-／GI~-／ORF1-ORF2~+对断奶仔猪的免疫原性试验 | 第100-103页 |
| ·伪狂犬病病毒的中和抗体水平检测 | 第100-101页 |
| ·伪狂犬病病毒ELISA抗体水平检测 | 第101页 |
| ·PCV2 ELISA抗体水平检测 | 第101-102页 |
| ·PCV2特异性的淋巴细胞增殖试验 | 第102-103页 |
| 第5章 讨论与结论 | 第103-114页 |
| ·讨论 | 第103-112页 |
| ·PCV2 ORF2基因的克隆与表达 | 第104-105页 |
| ·GST-ORF2融合蛋白的纯化 | 第105-107页 |
| ·包涵体蛋白的提取与纯化 | 第106-107页 |
| ·可溶性蛋白的纯化 | 第107页 |
| ·PCV2 ELISA方法的建立 | 第107-108页 |
| ·PCV2 ELISA方法与间接免疫荧光试剂盒的比较 | 第108页 |
| ·PCV2 ELISA方法的临床应用 | 第108-109页 |
| ·伪狂犬病病毒通用转移载体 | 第109页 |
| ·共转染与空斑纯化 | 第109页 |
| ·重组病毒的Southern blotting鉴定 | 第109-110页 |
| ·外源基因在重组病毒中的表达 | 第110-111页 |
| ·重组病毒诱导的免疫反应 | 第111-112页 |
| ·结论 | 第112-114页 |
| 参考文献 | 第114-128页 |
| 致谢 | 第128-129页 |
| 附录 | 第129页 |
