| 摘要 | 第1-17页 |
| ABSTRACT | 第17-21页 |
| 符号说明及缩写词 | 第21-23页 |
| 第一章 文献综述 | 第23-54页 |
| ·GroEL介绍 | 第23-29页 |
| ·分子伴侣的认知 | 第23-24页 |
| ·分子伴侣的经典定义及特征 | 第24-25页 |
| ·分子伴侣的分类及功能 | 第25-27页 |
| ·两个概念的澄清 | 第27-29页 |
| ·热激蛋白(heat shock protein,HSPs)与分子伴侣 | 第27-28页 |
| ·分子伴侣(moleculor chaperone)与伴侣素蛋白(chaperonin) | 第28-29页 |
| ·不同种类分子伴侣在蛋白质折叠过程中的关系 | 第29页 |
| ·GroEL的组成结构和作用机制 | 第29-42页 |
| ·GroEL及GroES的结构特征 | 第30-32页 |
| ·GroEL的作用机制 | 第32-34页 |
| ·GroEL助折叠过程中的别构效应 | 第32-33页 |
| ·ATP的功能 | 第33-34页 |
| ·GroEL对底物蛋白的折叠过程 | 第34-41页 |
| ·底物蛋白同GroEL的结合 | 第35-37页 |
| ·ATP和GroES同GroEL顺式环的结合——底物折叠过程 | 第37-39页 |
| ·顺式环上ATP的水解——底物释放的准备 | 第39-40页 |
| ·反式环上ATP的结合——底物释放 | 第40-41页 |
| ·GroEL对底物的识别机制 | 第41-42页 |
| ·groELs基因的相关研究 | 第42-45页 |
| ·groELs基因的特征 | 第42-43页 |
| ·不同种属菌中groELs功能研究概况 | 第43-44页 |
| ·groELs调控机制 | 第44-45页 |
| ·M.xanthus DK1 622的GroEL及其他伴侣蛋白研究进展 | 第45-51页 |
| ·粘细菌及其特征简介 | 第45-49页 |
| ·粘细菌多细胞群体行为之双运动系统 | 第45-47页 |
| ·粘细菌多细胞群体行为之发育 | 第47页 |
| ·粘细菌多细胞群体行为之摄食 | 第47-49页 |
| ·M.xanthus DK1622 GroEL及其他伴侣蛋白的功能 | 第49-50页 |
| ·GroES相关研究进展 | 第50-51页 |
| ·伴侣蛋白助溶体系的构建方法及应用 | 第51-54页 |
| ·多基因共表达策略简介 | 第51-53页 |
| ·单质粒多顺反子串联表达 | 第51-52页 |
| ·双质粒共表达 | 第52-53页 |
| ·伴侣蛋白助溶体系的应用 | 第53-54页 |
| 第二章 双拷贝groELs基因在黄色粘球菌DK1622生长和应激反应中的协作及表达变化 | 第54-103页 |
| ·实验材料 | 第55-59页 |
| ·菌株及质粒 | 第55-57页 |
| ·培养基 | 第57页 |
| ·实验试剂 | 第57-58页 |
| ·主要仪器设备 | 第58-59页 |
| ·实验方法 | 第59-77页 |
| ·质粒载体构建 | 第59-68页 |
| ·相关序列的克隆及处理 | 第59-62页 |
| ·质粒载体的酶切及连接、转化 | 第62-64页 |
| ·质粒载体构建流程图 | 第64-68页 |
| ·黄色粘球菌DK1622的电转化及突变子的筛选、纯化 | 第68-69页 |
| ·黄色粘球菌DK1622的电转化 | 第68页 |
| ·一次同源重组突变株的筛选及纯化 | 第68-69页 |
| ·基因敲除突变株的筛选及纯化 | 第69页 |
| ·突变子的保存 | 第69-70页 |
| ·插入失活突变株及报告基因融合表达菌株的PCR确证 | 第70页 |
| ·突变株的生长能力分析 | 第70-71页 |
| ·报告基因的表达检测 | 第71-72页 |
| ·X-gal平板显色实验 | 第71页 |
| ·β-半乳糖酶活测定方法 | 第71-72页 |
| ·热激条件下双拷贝groELs基因功能的差异 | 第72页 |
| ·热激对基因缺失突变株存活率影响的差异 | 第72页 |
| ·热激条件下细胞存活率差异的可视化展示 | 第72页 |
| ·热激条件下groELs表达量的变化 | 第72页 |
| ·其他应激条件下双拷贝groELs基因表达量变化的差异 | 第72-73页 |
| ·定量PCR检测groELs在生长阶段表达量的变化 | 第73-77页 |
| ·RNA的提取 | 第73页 |
| ·RNA浓度、纯度及完整性测定 | 第73-74页 |
| ·RNA中残余DNA的去除 | 第74页 |
| ·反转录PCR | 第74-75页 |
| ·实时荧光定量PCR | 第75-77页 |
| ·RT-PCR验证基因的表达 | 第77页 |
| ·结果与分析 | 第77-102页 |
| ·黄色粘球菌DK1622双拷贝groELs基因的插入失活 | 第77-80页 |
| ·黄色粘球菌DK1622双拷贝groELs的基因缺失分析 | 第80-82页 |
| ·groELs失活的异位回补-原位失活验证 | 第82-85页 |
| ·lacZ报告基因融合表达菌株的获得 | 第85-87页 |
| ·groELs qPCR检测方法的建立 | 第87-91页 |
| ·groELs在生长过程中的功能及表达分析 | 第91-96页 |
| ·groELs在生长过程中的功能分析 | 第91-92页 |
| ·双拷贝groELs基因在生长过程中的表达分析 | 第92-96页 |
| ·双拷贝groELs基因在热激过程中功能的差异 | 第96-99页 |
| ·双拷贝groELs基因在其他胁迫反应中的功能 | 第99-101页 |
| ·groELs基因双失活尝试的误区 | 第101-102页 |
| ·本章小结 | 第102-103页 |
| 第三章 双拷贝groELs基因在黄色粘球菌DK1622多细胞群体行为中的功能分化 | 第103-128页 |
| ·实验材料 | 第104-105页 |
| ·菌株及质粒 | 第104-105页 |
| ·培养基 | 第105页 |
| ·试剂及仪器设备 | 第105页 |
| ·实验方法 | 第105-110页 |
| ·groELs及其旁侧基因序列的提取及分析 | 第105-106页 |
| ·质粒载体构建 | 第106-108页 |
| ·相关序列的克隆及处理 | 第106-107页 |
| ·质粒载体构建流程图 | 第107-108页 |
| ·黄色粘球菌DK1622的电转化及突变子的筛选、纯化 | 第108页 |
| ·过表达菌株的验证 | 第108页 |
| ·菌株的生孢和发育能力分析 | 第108页 |
| ·菌株的运动能力分析 | 第108-109页 |
| ·菌株的摄食能力分析 | 第109-110页 |
| ·菌株在活大肠杆菌上的摄食能力分析 | 第109页 |
| ·菌株在干酪素(Casein)中的生长能力分析 | 第109-110页 |
| ·结果与分析 | 第110-127页 |
| ·不同种属粘细菌双拷贝groELs基因分析 | 第110-113页 |
| ·不同种属粘细菌双拷贝groELs存在的普遍性及其在基因组上的组成结构特征 | 第110-112页 |
| ·已测序不同种属粘细菌双拷贝groELs的系统发育分析 | 第112-113页 |
| ·双拷贝groELs基因在运动中的功能分析 | 第113-115页 |
| ·双拷贝groELs基因在发育过程中的表达及功能分析 | 第115-124页 |
| ·双拷贝groELs基因在生孢和发育过程中的功能分析 | 第116-118页 |
| ·groEL1下调表达对菌体发育的影响 | 第118-119页 |
| ·groELs在发育过程中的表达 | 第119-120页 |
| ·过表达groEL2对菌体发育的影响 | 第120-124页 |
| ·双拷贝groELs在摄食过程中的功能分析 | 第124-127页 |
| ·菌株分解活菌的摄食能力分析 | 第124-126页 |
| ·菌株降解大分子底物的feeding能力分析 | 第126-127页 |
| ·本章小结 | 第127-128页 |
| 第四章 粘细菌GroEL助溶体系的建立和应用 | 第128-172页 |
| ·实验材料 | 第129-133页 |
| ·菌株及质粒 | 第129-131页 |
| ·培养基 | 第131页 |
| ·实验试剂 | 第131-132页 |
| ·仪器设备与耗材 | 第132-133页 |
| ·实验方法 | 第133-147页 |
| ·基因共表达策略的选择 | 第133页 |
| ·质粒载体构建的流程和方法 | 第133-143页 |
| ·目的片段的克隆及处理 | 第133-136页 |
| ·不相容质粒共表达相关质粒载体的构建 | 第136-138页 |
| ·单一质粒串联共表达相关质粒载体的构建 | 第138-141页 |
| ·相容质粒共表达相关质粒载体的构建 | 第141-142页 |
| ·其他载体的构建 | 第142-143页 |
| ·蛋白的诱导表达及检测 | 第143-144页 |
| ·异源蛋白的诱导表达 | 第143页 |
| ·目标蛋白的检测 | 第143-144页 |
| ·蛋白纯化 | 第144-146页 |
| ·可溶性蛋白的非变性纯化 | 第144-145页 |
| ·可溶性蛋白的尿素变性纯化 | 第145-146页 |
| ·包涵体蛋白的溶解纯化 | 第146页 |
| ·苹果酸脱氢酶(MDH)的体外复性 | 第146-147页 |
| ·结果与分析 | 第147-171页 |
| ·GroEL潜在负调控蛋白HrcA的表达及纯化 | 第147-153页 |
| ·HrcA蛋白的异源表达及表达状态分析 | 第147-148页 |
| ·HrcA蛋白表达条件的优化 | 第148-149页 |
| ·HrcA蛋白在不同溶液中溶解性比较分析 | 第149-150页 |
| ·HrcA蛋白的离子敏感性分析 | 第150-151页 |
| ·HrcA蛋白的纯化 | 第151-153页 |
| ·三种蛋白共表达策略的比较分析 | 第153-162页 |
| ·不相容质粒共表达体系的构建及蛋白共表达分析 | 第153-156页 |
| ·不相容质粒共表达相关质粒的构建 | 第153页 |
| ·不相容质粒共转化 | 第153-154页 |
| ·不相容质粒共表达蛋白的诱导表达 | 第154-156页 |
| ·同一载体串联共表达结果分析 | 第156-160页 |
| ·单个基因表达质粒的构建和蛋白的表达检测 | 第156-157页 |
| ·两个基因串联共表达质粒构建及蛋白表达检测 | 第157-158页 |
| ·三个基因串联共表达质粒构建及蛋白表达检测 | 第158-160页 |
| ·相容性质粒共表达体系的建立及其优化 | 第160-162页 |
| ·黄色粘球菌DK1622中双拷贝的groELs共用同一个groES基因关系揭示 | 第162-167页 |
| ·黄色粘球菌DK1622中groES基因敲除的实验启示 | 第163-164页 |
| ·HrcA的体内助折叠分析 | 第164-165页 |
| ·MDH体外复性分析 | 第165-166页 |
| ·黄色粘球菌DK1622 GroEL和GroES的Native-PAGE | 第166-167页 |
| ·纤维堆囊菌0157-2GroEL助溶体系助溶HrcA的启示 | 第167-171页 |
| ·纤维堆囊菌0157-2 GroEL助折叠体系的构建 | 第167-168页 |
| ·纤维堆囊菌0157-2 groEL2与双拷贝的groESs的关系分析 | 第168-169页 |
| ·纤维堆囊菌0157-2两种GroELs的底物特异性 | 第169-171页 |
| ·本章小结 | 第171-172页 |
| 总结与展望 | 第172-174页 |
| 附录 | 第174-179页 |
| 参考文献 | 第179-189页 |
| 致谢 | 第189-190页 |
| 英文论文一 | 第190-211页 |
| 英文论文二 | 第211-226页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第226页 |
