| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第一章 绪论 | 第16-22页 |
| 1.1 纤维素及纤维素酶 | 第16-17页 |
| 1.2 半纤维素及半纤维素酶 | 第17-18页 |
| 1.3 丝状真菌转录调控因子 | 第18-20页 |
| 1.3.1 纤维素酶调控因子 | 第18-19页 |
| 1.3.2 氮代谢调控因子 | 第19-20页 |
| 1.3.3 pH调控因子 | 第20页 |
| 1.4 本论文研究的目的和内容 | 第20-22页 |
| 1.4.1 研究的意义 | 第20-21页 |
| 1.4.2 研究的内容 | 第21-22页 |
| 第二章 东方肉座菌转录调控基因ace3的缺失突变 | 第22-55页 |
| 2.1 材料和方法 | 第22-39页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第22页 |
| 2.1.2 培养基及主要试剂 | 第22-23页 |
| 2.1.3 实验相关设备 | 第23页 |
| 2.1.4 东方肉质座菌总DNA的提取 | 第23-24页 |
| 2.1.5 引物设计 | 第24页 |
| 2.1.6 转录调控因子基因ace3 PCR扩增条件 | 第24-25页 |
| 2.1.7 大肠杆菌DH5a的制备与转化 | 第25-26页 |
| 2.1.8 转录调控基因ace3生物信息学分析 | 第26页 |
| 2.1.9 敲除盒Aace3::hph的构建 | 第26-28页 |
| 2.1.10 原生质体制备与转化 | 第28-29页 |
| 2.1.11 △ace3转化子分析 | 第29-31页 |
| 2.1.12 △ace3敲除菌纤维素酶活测定 | 第31-35页 |
| 2.1.13 发酵上清液蛋白浓度测定Bradford法 | 第35-36页 |
| 2.1.14 粗酶液制备 | 第36页 |
| 2.1.15 SDS-PAGE电泳分析 | 第36页 |
| 2.1.16 发酵上清液pH测定 | 第36页 |
| 2.1.17 菌落生长速度与表型分析 | 第36-37页 |
| 2.1.18 荧光定量PCR分析产酶基因转录水平 | 第37-39页 |
| 2.2 结果与分析 | 第39-51页 |
| 2.2.1 ace3上下游基因序列的克隆 | 第39-41页 |
| 2.2.2 东方肉座菌ace3基因序列克隆 | 第41-42页 |
| 2.2.3 △ace3转化子分子检测 | 第42-43页 |
| 2.2.4 标准曲线绘制 | 第43-44页 |
| 2.2.5 △ace3转化子产酶分析 | 第44-45页 |
| 2.2.6 △ace3敲除菌发酵液蛋白含量与pH测定 | 第45-47页 |
| 2.2.7 转化子表型分析 | 第47-48页 |
| 2.2.8 △ace3敲除菌菌落生长速率测定 | 第48-50页 |
| 2.2.9 荧光定量PCR分析△ace3转化子产酶基因相对表达量 | 第50-51页 |
| 2.3 讨论与小结 | 第51-55页 |
| 2.3.1 讨论 | 第51-53页 |
| 2.3.2 小结 | 第53-55页 |
| 第三章 东方肉座菌β-葡萄糖苷酶转录调控基因bglr的缺失突变 | 第55-72页 |
| 3.1 材料与方法 | 第55-62页 |
| 3.1.1 菌株与质粒 | 第55页 |
| 3.1.2 培养基及试剂 | 第55页 |
| 3.1.3 实验仪器 | 第55页 |
| 3.1.4 引物设计 | 第55-57页 |
| 3.1.5 东方肉座菌中EU7-22 bglr基因克隆 | 第57页 |
| 3.1.6 利用热不对称PCR (TAIL-PCR)对bglr基因上游游同源臂克隆 | 第57-59页 |
| 3.1.7 △bglr::hph敲除盒构建 | 第59-60页 |
| 3.1.8 原生质体制备及转化 | 第60-61页 |
| 3.1.9 △bglr转化子验证 | 第61页 |
| 3.1.10 发酵液蛋白含量与pH值测定分析 | 第61页 |
| 3.1.11 △bglr转化子产酶分析 | 第61-62页 |
| 3.1.12 △bglr转化子表型及生长速率分析 | 第62页 |
| 3.1.13 荧光定量PCR分析葡萄糖苷酶基因bgll | 第62页 |
| 3.2 结果与分析 | 第62-70页 |
| 3.2.1 东方肉座菌bglr基因未知序列的克隆 | 第62-63页 |
| 3.2.2 △bglr::hph敲除盒构建 | 第63-64页 |
| 3.2.3 △bglr转化子验证 | 第64-65页 |
| 3.2.4 突变菌△bglr产酶分析 | 第65-66页 |
| 3.2.5 △bglr敲除菌发酵液中蛋白含量与pH变化的研究 | 第66-68页 |
| 3.2.6 突变菌△bglr表型及生长速率分析 | 第68-69页 |
| 3.2.7 荧光定量PCR分析β-葡萄糖苷酶产酶基因bgll达量 | 第69-70页 |
| 3.3 讨论与小结 | 第70-72页 |
| 3.3.1 讨论 | 第70-71页 |
| 3.3.2 小结 | 第71-72页 |
| 第四章 转录调控因子ACE3和BglR保守序列分析以及ace3基因过表达盒的构建 | 第72-80页 |
| 4.1 材料与方法 | 第72-73页 |
| 4.1.1 菌株与质粒 | 第72页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第72页 |
| 4.1.3 氨基酸序列比对分析 | 第72页 |
| 4.1.4 里氏木霉QM6a中cbhl启动子与终止子PCR扩增条件与相关引物设计 | 第72-73页 |
| 4.2 结果与分析 | 第73-79页 |
| 4.2.1 转录调控因子ACE3同源序列分析 | 第73-76页 |
| 4.2.2 转录调控因子BglR同源序列分析 | 第76-78页 |
| 4.2.3 基因ace3过表达盒的构建 | 第78-79页 |
| 4.3 讨论与小结 | 第79-80页 |
| 第五章 全文总结与展望 | 第80-83页 |
| 5.1 结论 | 第80-81页 |
| 5.2 展望 | 第81-83页 |
| 附录Ⅰ 实验仪器设备 | 第83-85页 |
| 参考文献 | 第85-91页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第91-92页 |
| 致谢 | 第92页 |
