| 致谢 | 第5-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 目录 | 第12-16页 |
| 第一章 绪论 | 第16-31页 |
| 1.1 γ-氨基丁酸 | 第16-20页 |
| 1.1.1 GABA的生理功能 | 第16-17页 |
| 1.1.2 GABA的制备方法 | 第17-20页 |
| 1.2 谷氨酸脱羧酶 | 第20-23页 |
| 1.2.1 动物来源GAD | 第20页 |
| 1.2.2 植物来源GAD | 第20-21页 |
| 1.2.3 微生物来源GAD | 第21-23页 |
| 1.3 酶工程的新浪潮 | 第23-27页 |
| 1.4 计算机辅助设计在酶工程中的应用 | 第27-29页 |
| 1.5 研究目的和内容 | 第29-31页 |
| 第二章 谷氨酸脱羧酶活性高通量筛选方法的建立 | 第31-41页 |
| 2.1 引言 | 第31-32页 |
| 2.2 材料和方法 | 第32-35页 |
| 2.2.1 化学试剂 | 第32页 |
| 2.2.2 质粒与菌株 | 第32-33页 |
| 2.2.3 主要仪器 | 第33页 |
| 2.2.4 培养基的配制 | 第33页 |
| 2.2.5 GAD的诱导表达 | 第33-34页 |
| 2.2.6 GAD活力的分光光度法检测 | 第34页 |
| 2.2.7 高通量筛选方法的应用 | 第34-35页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第35-40页 |
| 2.3.1 pH指示剂/缓冲液体系的选择 | 第35-37页 |
| 2.3.2 质子消耗速率与吸光度变化的线性关联 | 第37页 |
| 2.3.3 GAD酶活测定 | 第37-38页 |
| 2.3.4 高通量筛选的适用性研究 | 第38-40页 |
| 2.4 本章小结 | 第40-41页 |
| 第三章 短乳杆菌谷氨酸脱羧酶的同源模建 | 第41-56页 |
| 3.1 引言 | 第41-42页 |
| 3.2 同源模建的方法和步骤 | 第42-45页 |
| 3.2.1 序列来源 | 第42页 |
| 3.2.2 模建方法 | 第42-44页 |
| 3.2.3 模型的质量评价 | 第44-45页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第45-55页 |
| 3.3.1 模板的选择 | 第45-46页 |
| 3.3.2 短乳杆菌GAD与模板蛋白的氨基酸序列比对 | 第46-47页 |
| 3.3.3 模型的构建 | 第47-48页 |
| 3.3.4 模型质量评估 | 第48-51页 |
| 3.3.5 短乳杆菌GAD三维结构的总体特征 | 第51-52页 |
| 3.3.6 短乳杆菌GAD活性中心的特点 | 第52-55页 |
| 3.4 本章小结 | 第55-56页 |
| 第四章 谷氨酸脱羧酶的分子对接研究 | 第56-79页 |
| 4.1 引言 | 第56-59页 |
| 4.1.1 分子对接的概念 | 第56-57页 |
| 4.1.2 搜索算法和打分函数 | 第57页 |
| 4.1.3 分子对接软件 | 第57-58页 |
| 4.1.4 ROSETTALIGAND对接程序 | 第58-59页 |
| 4.2 分子对接的方法和步骤 | 第59-63页 |
| 4.2.1 受体与配体 | 第59页 |
| 4.2.2 计算平台 | 第59-60页 |
| 4.2.3 分子对接流程 | 第60-63页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第63-77页 |
| 4.3.1 受体蛋白质的处理 | 第63-64页 |
| 4.3.2 配体分子的处理 | 第64-69页 |
| 4.3.3 反应过渡态模拟 | 第69-72页 |
| 4.3.4 分子对接结果及分析 | 第72-77页 |
| 4.4 本章小结 | 第77-79页 |
| 第五章 C末端缺失的GAD突变体的设计与构建 | 第79-95页 |
| 5.1 引言 | 第79页 |
| 5.2 材料和方法 | 第79-85页 |
| 5.2.1 质粒与菌株 | 第79-80页 |
| 5.2.2 酶和试剂 | 第80页 |
| 5.2.3 主要仪器 | 第80页 |
| 5.2.4 GAD模型构建 | 第80页 |
| 5.2.5 C末端缺失GAD突变体的构建 | 第80-81页 |
| 5.2.6 目的蛋白的表达与纯化 | 第81-82页 |
| 5.2.7 GAD分子量的测定 | 第82-83页 |
| 5.2.8 酶活力测定 | 第83-84页 |
| 5.2.9 蛋白质光谱分析 | 第84-85页 |
| 5.3 结果和讨论 | 第85-94页 |
| 5.3.1 定点突变产物的电泳分析 | 第85-86页 |
| 5.3.2 GAD的分子量 | 第86-87页 |
| 5.3.3 同源模建结果 | 第87-89页 |
| 5.3.4 酶的催化特性 | 第89-90页 |
| 5.3.5 酶的光谱特征 | 第90-94页 |
| 5.4 本章小结 | 第94-95页 |
| 第六章 基于计算机辅助设计的GAD热稳定性改造 | 第95-111页 |
| 6.1 引言 | 第95-98页 |
| 6.1.1 酶的热稳定机制 | 第96-97页 |
| 6.1.2 提高酶热稳定性的策略 | 第97-98页 |
| 6.2 材料与方法 | 第98-102页 |
| 6.2.1 实验材料 | 第98页 |
| 6.2.2 主要仪器 | 第98页 |
| 6.2.3 计算机辅助设计 | 第98-99页 |
| 6.2.4 突变位点预测 | 第99-101页 |
| 6.2.5 突变体构建 | 第101页 |
| 6.2.6 突变酶的表达与纯化 | 第101页 |
| 6.2.7 突变酶活力的初筛 | 第101页 |
| 6.2.8 热稳定突变酶的复筛 | 第101-102页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第102-110页 |
| 6.3.1 RosettaDesign的计算结果 | 第102-103页 |
| 6.3.2 预测位点的定点突变 | 第103-105页 |
| 6.3.3 粗酶活力筛选 | 第105-106页 |
| 6.3.4 酶的纯化及热稳定性研究 | 第106-109页 |
| 6.3.5 热稳定性提高的原因分析 | 第109-110页 |
| 6.4 本章小结 | 第110-111页 |
| 第七章 结论与展望 | 第111-115页 |
| 7.1 总结 | 第111-113页 |
| 7.2 展望 | 第113-115页 |
| 参考文献 | 第115-128页 |
| 附录1 短乳杆菌GAD的序列 | 第128-129页 |
| 附录2 ROSETTALIGAND源代码 | 第129-132页 |
| 附录3 对接参数文件flags.txt | 第132-133页 |
| 附录4 蛋白质分析检测方法 | 第133-135页 |
| 附录5 20种标准氨基酸列表 | 第135-136页 |
| 攻读博士学位期间的科研成果 | 第136页 |