| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 第一章 引言 | 第17-40页 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌Cry蛋白 | 第17-25页 |
| 1.1.1 3d-Cry蛋白的结构 | 第18-21页 |
| 1.1.2 3d-Cry蛋白对靶标害虫的杀虫作用机制 | 第21-22页 |
| 1.1.3 其它Cry蛋白 | 第22-25页 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌Vip蛋白 | 第25-33页 |
| 1.2.1 Vip3蛋白的结构 | 第25-28页 |
| 1.2.2 Vip3蛋白杀虫作用机制 | 第28-32页 |
| 1.2.3 其它Vip蛋白 | 第32-33页 |
| 1.3 协同增效杀虫作用机制 | 第33-36页 |
| 1.3.1 Cry和Vip蛋白之间的增效作用 | 第33-34页 |
| 1.3.2 Cry和Cyt蛋白的增效作用 | 第34页 |
| 1.3.3 Cry蛋白和受体钙粘蛋白的增效作用 | 第34-35页 |
| 1.3.4 Cry蛋白之间的增效作用 | 第35页 |
| 1.3.5 Cry蛋白和其它物质的增效作用 | 第35-36页 |
| 1.4 昆虫对苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白的抗性机制 | 第36页 |
| 1.5 本研究涉及的主要鳞翅目害虫 | 第36-37页 |
| 1.5.1 水稻二化螟 | 第36页 |
| 1.5.2 亚洲玉米螟 | 第36-37页 |
| 1.5.3 东方粘虫 | 第37页 |
| 1.6 本研究涉及的苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白 | 第37-38页 |
| 1.6.1 Cry9Aa和Cry9Ee蛋白 | 第37页 |
| 1.6.2 Vip3Aa蛋白 | 第37-38页 |
| 1.6.3 Cry1Bb蛋白 | 第38页 |
| 1.7 研究目的、意义和立题依据 | 第38-39页 |
| 1.8 主要研究内容 | 第39-40页 |
| 1.8.1 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白组合在水稻二化螟BBMV上的结合分析 | 第39页 |
| 1.8.2 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白之间的结合分析 | 第39页 |
| 1.8.3 Cry9Aa与Vip3Aa蛋白结合位点的确定 | 第39页 |
| 1.8.4 对两种玉米害虫具有协同增效杀虫活性的Bt蛋白组合筛选 | 第39页 |
| 1.8.5 亚洲玉米螟对Cry9Ee和Cry1Ab蛋白的交互抗性机制分析 | 第39-40页 |
| 第二章 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白与BBMV的结合以及两蛋白间的结合分析 | 第40-53页 |
| 2.1 实验材料 | 第40-42页 |
| 2.1.1 菌株信息 | 第40页 |
| 2.1.2 供试昆虫 | 第40页 |
| 2.1.3 实验试剂与耗材 | 第40-41页 |
| 2.1.4 培养基与抗生素 | 第41页 |
| 2.1.5 常用溶液与缓冲液 | 第41页 |
| 2.1.6 主要仪器设备 | 第41-42页 |
| 2.2 实验方法 | 第42-45页 |
| 2.2.1 蛋白的提取 | 第42页 |
| 2.2.2 蛋白的亲和纯化 | 第42页 |
| 2.2.3 蛋白的活化 | 第42页 |
| 2.2.4 蛋白的凝胶过滤纯化 | 第42-43页 |
| 2.2.5 Bradford法测定蛋白浓度 | 第43页 |
| 2.2.6 蛋白的生物素标记 | 第43页 |
| 2.2.7 BBMV的提取 | 第43-44页 |
| 2.2.8 APN酶活测定 | 第44页 |
| 2.2.9 Cry9Aa(或Vip3Aa)与BBMV的饱和结合实验 | 第44页 |
| 2.2.10 Cry9Aa(或Vip3Aa)与BBMV的同源竞争结合实验 | 第44页 |
| 2.2.11 Cry9Aa(或Vip3Aa)与BBMV的异源竞争结合实验 | 第44-45页 |
| 2.2.12 Ligand-blot实验 | 第45页 |
| 2.2.13 ELISA实验 | 第45页 |
| 2.3 结果与分析 | 第45-52页 |
| 2.3.1 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白的提取与纯化 | 第45-46页 |
| 2.3.2 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白的活化 | 第46-47页 |
| 2.3.3 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白的凝胶过滤纯化 | 第47页 |
| 2.3.4 Western-blot检测Cry9Aa和Vip3Aa蛋白的生物素标记情况 | 第47-48页 |
| 2.3.5 BBMV的提取与APN酶活测定 | 第48页 |
| 2.3.6 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白与BBMV饱和结合情况 | 第48页 |
| 2.3.7 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白与BBMV同源竞争结合情况 | 第48-49页 |
| 2.3.8 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白与BBMV异源竞争结合情况 | 第49页 |
| 2.3.9 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白之间的Ligand-blot结合分析 | 第49-50页 |
| 2.3.10 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白之间的ELISA结合分析 | 第50-52页 |
| 2.4 讨论 | 第52页 |
| 2.5 小结 | 第52-53页 |
| 第三章 Cry9Aa蛋白协同增效关键位点的确定 | 第53-68页 |
| 3.1 实验材料 | 第53-55页 |
| 3.1.1 菌株与质粒 | 第53页 |
| 3.1.2 引物 | 第53-54页 |
| 3.1.3 供试昆虫 | 第54页 |
| 3.1.4 实验试剂与耗材 | 第54-55页 |
| 3.1.5 常用溶液与缓冲液 | 第55页 |
| 3.1.6 主要仪器设备 | 第55页 |
| 3.2 实验方法 | 第55-59页 |
| 3.2.1 结构预测与序列比对分析 | 第55页 |
| 3.2.2 PCR克隆Cry9Aa各结构域片段 | 第55页 |
| 3.2.3 DNA片段双酶切及纯化 | 第55-56页 |
| 3.2.4 连接反应 | 第56页 |
| 3.2.5 电击转化 | 第56页 |
| 3.2.6 阳性克隆的鉴定 | 第56页 |
| 3.2.7 热激转化 | 第56-57页 |
| 3.2.8 合成多肽的结合分析 | 第57页 |
| 3.2.9 Cry9Aa突变体的构建 | 第57-58页 |
| 3.2.10 Cry9Aa突变体蛋白提取、纯化与定量 | 第58页 |
| 3.2.11 水稻二化螟杀虫活性测定 | 第58-59页 |
| 3.2.12 增效因子的计算 | 第59页 |
| 3.3 实验结果与分析 | 第59-67页 |
| 3.3.1 Cry9Aa蛋白的结构与疏水性分析 | 第59-60页 |
| 3.3.2 Cry9Aa蛋白结构域的分段表达 | 第60-61页 |
| 3.3.3 Cry9Aa各结构域片段与Vip3Aa蛋白的结合分析 | 第61-62页 |
| 3.3.4 Cry9Aa的loop突变体与Vip3Aa蛋白的结合分析 | 第62-63页 |
| 3.3.5 Cry9Aa合成肽段与Vip3Aa蛋白的结合情况分析 | 第63-64页 |
| 3.3.6 Cry9Aa参与结合的表位分析 | 第64页 |
| 3.3.7 Cry9Aa突变体的构建与表达 | 第64-65页 |
| 3.3.8 Cry9Aa突变体与Vip3Aa蛋白的结合分析 | 第65-66页 |
| 3.3.9 水稻二化螟杀虫活性测定 | 第66-67页 |
| 3.4 讨论 | 第67页 |
| 3.5 小结 | 第67-68页 |
| 第四章 Vip3Aa蛋白协同增效关键位点的确定 | 第68-78页 |
| 4.1 实验材料 | 第68-70页 |
| 4.1.1 质粒信息 | 第68-69页 |
| 4.1.2 引物 | 第69-70页 |
| 4.1.3 供试昆虫 | 第70页 |
| 4.1.4 实验试剂与仪器设备 | 第70页 |
| 4.2 实验方法 | 第70页 |
| 4.2.1 Vip3Aa蛋白二级结构的预测 | 第70页 |
| 4.3 实验结果与分析 | 第70-76页 |
| 4.3.0 Vip3Aa蛋白重叠片段的构建与表达 | 第70-72页 |
| 4.3.1 Vip3Aa重叠片段与Cry9Aa蛋白的结合情况分析 | 第72-73页 |
| 4.3.2 Vip3Aa合成多肽与Cry9Aa蛋白的结合分析 | 第73页 |
| 4.3.3 Vip3Aa蛋白突变体的构建与表达 | 第73页 |
| 4.3.4 Vip3Aa突变体与Cry9Aa蛋白的结合分析 | 第73-74页 |
| 4.3.5 Vip3Aa蛋白二级结构的模拟 | 第74页 |
| 4.3.6 水稻二化螟的杀虫活性测定 | 第74-76页 |
| 4.4 讨论 | 第76-77页 |
| 4.5 小结 | 第77-78页 |
| 第五章 对玉米害虫协同增效Bt杀虫蛋白组合的筛选 | 第78-92页 |
| 5.1 实验材料 | 第78-79页 |
| 5.1.1 菌株与质粒 | 第78-79页 |
| 5.1.2 引物 | 第79页 |
| 5.1.3 供试昆虫 | 第79页 |
| 5.1.4 实验试剂 | 第79页 |
| 5.1.5 常用溶液与缓冲液 | 第79页 |
| 5.2 实验方法 | 第79-82页 |
| 5.2.1 Bt杀虫基因的克隆 | 第79-80页 |
| 5.2.2 DNA片段双酶切及纯化 | 第80页 |
| 5.2.3 连接反应 | 第80-81页 |
| 5.2.4 热激转化 | 第81页 |
| 5.2.5 阳性克隆的鉴定 | 第81页 |
| 5.2.6 HD73-无晶体突变株感受态制备 | 第81页 |
| 5.2.7 电击转化 | 第81-82页 |
| 5.2.8 晶体形态观察 | 第82页 |
| 5.2.9 亚洲玉米螟和东方粘虫杀虫活性测定 | 第82页 |
| 5.3 实验结果与分析 | 第82-90页 |
| 5.3.1 Cry9Ee蛋白表达载体的构建 | 第82-83页 |
| 5.3.2 Cry9Ee蛋白在Bt中的表达 | 第83-84页 |
| 5.3.3 Cry9Ee蛋白的提取 | 第84页 |
| 5.3.4 Cry1Bb蛋白的载体构建与表达 | 第84-85页 |
| 5.3.5 Cry1Bb蛋白Ni亲和纯化 | 第85-86页 |
| 5.3.6 Cry1Ah和Cry1Ie蛋白的提取与纯化 | 第86页 |
| 5.3.7 亚洲玉米螟及东方粘虫杀虫活性测定 | 第86-88页 |
| 5.3.8 亚洲玉米螟BBMV的提取和定量 | 第88-89页 |
| 5.3.9 Cry9Ee与Cry1Ab在BBMV上的竞争结合实验 | 第89-90页 |
| 5.4 讨论 | 第90-91页 |
| 5.5 小结 | 第91-92页 |
| 第六章 全文结论 | 第92-93页 |
| 参考文献 | 第93-105页 |
| 致谢 | 第105-107页 |
| 作者简历 | 第107-108页 |
