| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 英文缩略词表 | 第12-13页 |
| 第一章 前言 | 第13-28页 |
| 1 蒎烯 | 第13-17页 |
| 1.1 简介 | 第13页 |
| 1.2 用途 | 第13-17页 |
| 1.2.1 高能燃料 | 第14-16页 |
| 1.2.2 药理活性物 | 第16页 |
| 1.2.3 高分子材料 | 第16页 |
| 1.2.4 合成香料 | 第16-17页 |
| 2 合成生物学简介 | 第17-21页 |
| 2.1 合成生物学概述 | 第17-18页 |
| 2.2 基因(组)编辑技术在合成生物学中的应用 | 第18-19页 |
| 2.3 合成生物学在生物制造方面的应用 | 第19-21页 |
| 2.3.1 合成天然药物 | 第19-20页 |
| 2.3.2 合成替代能源 | 第20-21页 |
| 3 萜类化合物的生物合成研究进展 | 第21-25页 |
| 3.1 萜类化合物分类及应用 | 第21页 |
| 3.2 萜类的代谢途径 | 第21-23页 |
| 3.3 萜类化合物的合成生物学研究进展 | 第23-24页 |
| 3.4 蒎烯的微生物代谢合成研究进展 | 第24-25页 |
| 4 研究思路及研究意义 | 第25-28页 |
| 4.1 研究思路 | 第25-26页 |
| 4.2 研究意义 | 第26-28页 |
| 第二章 GPPS和PS共表达及融合表达载体的构建 | 第28-48页 |
| 1 实验材料 | 第28-30页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第28页 |
| 1.2 主要试剂 | 第28-29页 |
| 1.3 培养基及主要溶液 | 第29-30页 |
| 1.4 主要仪器 | 第30页 |
| 2 方法 | 第30-41页 |
| 2.1 目的基因的获取 | 第30页 |
| 2.2 共表达载体的构建 | 第30-36页 |
| 2.2.1 目的基因的转化 | 第31页 |
| 2.2.2 质粒提取 | 第31-32页 |
| 2.2.3 目的基因PCR扩增并引入酶切位点 | 第32页 |
| 2.2.4 PCR产物凝胶电泳及胶回收 | 第32-33页 |
| 2.2.5 TA克隆 | 第33页 |
| 2.2.6 连接产物的转化 | 第33-34页 |
| 2.2.7 目的重组质粒的筛选与鉴定 | 第34页 |
| 2.2.8 目的片段的双酶切与胶回收 | 第34-35页 |
| 2.2.9 构建中间载体pETDuet1-GPPS | 第35页 |
| 2.2.10 中间载体pETDuet1-GPPS的酶切鉴定 | 第35页 |
| 2.2.11 构建共表达载体pETDuet1-GPPS-PS | 第35-36页 |
| 2.3 融合表达载体的构建 | 第36-40页 |
| 2.3.1 融合PCR构建GPPS-PS融合表达基因 | 第36-38页 |
| 2.3.2 目的基因双酶切 | 第38页 |
| 2.3.3 酶切产物清洁回收 | 第38页 |
| 2.3.4 构建融合表达载体 | 第38-39页 |
| 2.3.5 融合表达载体酶切鉴定 | 第39页 |
| 2.3.6 GPPS和PS共表达及融合表达菌株的构建 | 第39页 |
| 2.3.7 SDS-PAGE验证基因的表达 | 第39-40页 |
| 2.4 评价外源基因表达对菌生长的影响 | 第40页 |
| 2.5 检测蒎烯产量 | 第40-41页 |
| 2.5.1 菌液培养 | 第40页 |
| 2.5.2 确定检测方法 | 第40-41页 |
| 2.5.3 GC-MS检测蒎烯 | 第41页 |
| 3 结果 | 第41-47页 |
| 3.1 人工合成目的基因 | 第41-42页 |
| 3.2 共表达载体的构建与基因表达 | 第42页 |
| 3.3 融合表达载体的构建与基因表达 | 第42-43页 |
| 3.4 外源基因表达对工程菌生长的影响 | 第43页 |
| 3.5 GC-MS检测蒎烯 | 第43-47页 |
| 3.5.1 蒎烯的定性检测 | 第43-44页 |
| 3.5.2 制作蒎烯浓度标准曲线 | 第44-45页 |
| 3.5.3 蒎烯检测方法的重复性考察 | 第45-46页 |
| 3.5.4 融合表达及共表达菌株产蒎烯能力的检测 | 第46-47页 |
| 4 本章小结 | 第47-48页 |
| 第三章 MVA代谢途径产蒎烯工程菌的构建 | 第48-70页 |
| 1 实验材料 | 第48-51页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第48页 |
| 1.2 主要试剂 | 第48-49页 |
| 1.3 培养基及主要溶液 | 第49-50页 |
| 1.4 主要仪器 | 第50-51页 |
| 2 方法 | 第51-63页 |
| 2.1 MVA上游途径表达载体的构建 | 第51-54页 |
| 2.1.1 mvaE、mvaS基因的获取 | 第51页 |
| 2.1.2 目的基因及载体双酶切 | 第51-52页 |
| 2.1.3 酶连目的基因及表达载体 | 第52页 |
| 2.1.4 MVA上游途径表达载体的鉴定 | 第52页 |
| 2.1.5 SDS-PAGE检测基因表达 | 第52-53页 |
| 2.1.6 mvaS基因点突变 | 第53-54页 |
| 2.2 MVA下游途径表达载体的构建 | 第54-60页 |
| 2.2.1 酿酒酵母基因组的提取 | 第54页 |
| 2.2.2 目的基因的克隆 | 第54-55页 |
| 2.2.3 将目的基因连接到pMD18-T载体上 | 第55页 |
| 2.2.4 目的基因的改造 | 第55-56页 |
| 2.2.5 BioBrick单基因表达载体的构建 | 第56-57页 |
| 2.2.6 BioBrick方法构建多基因共表达载体 | 第57-58页 |
| 2.2.7 SDS-PAGE验证目的基因的表达 | 第58页 |
| 2.2.8 构建多基因串联共表达载体 | 第58-60页 |
| 2.2.9 SDS-PAGE验证目的基因的表达 | 第60页 |
| 2.3 构建表达载体pACYCDuet-mvaE/S-GPPS-PS | 第60-62页 |
| 2.3.1 GPPS-PS融合基因PCR | 第60-61页 |
| 2.3.2 DNA片段双酶切 | 第61页 |
| 2.3.3 酶连目的基因及载体 | 第61页 |
| 2.3.4 酶切鉴定 | 第61-62页 |
| 2.3.5 SDS-PAGE验证目的基因的表达 | 第62页 |
| 2.4 构建表达载体pACYCDuet-mvaE/S_(G110)-GPPS-PS | 第62页 |
| 2.5 含MVA代谢途径产蒎烯工程菌的构建 | 第62-63页 |
| 2.6 工程菌产蒎烯能力的检测 | 第63页 |
| 2.6.1 工程菌的摇床培养 | 第63页 |
| 2.6.2 GC-MS检测蒎烯 | 第63页 |
| 3 实验结果 | 第63-69页 |
| 3.1 载体pACYCDuet-mvaE/S及蛋白表达验证 | 第63-64页 |
| 3.2 mvaS点突变 | 第64-65页 |
| 3.3 点突变消除Xba Ⅰ酶切位点 | 第65页 |
| 3.4 BioBrick单基因表达载体的构建及基因表达验证 | 第65-66页 |
| 3.5 BioBrick方法构建MVA途径共表达载体 | 第66页 |
| 3.6 多顺反子模型原理构建MVA下游途径共表达载体 | 第66-67页 |
| 3.7 pACYCDuet-mvaE/S-GPPS-PS载体的构建与鉴定 | 第67-68页 |
| 3.8 pACYCDuet-mvaE/S_(G110)-GPPS-PS载体的构建与鉴定 | 第68页 |
| 3.9 工程菌产蒎烯能力的检测 | 第68-69页 |
| 4 本章小结 | 第69-70页 |
| 第四章 CRISPR/Cas9技术改造大肠杆菌基因组 | 第70-87页 |
| 1 实验材料 | 第70-72页 |
| 1.1 质粒和菌株 | 第70页 |
| 1.2 主要试剂 | 第70-71页 |
| 1.3 培养基及主要溶液 | 第71页 |
| 1.4 主要仪器 | 第71-72页 |
| 2 方法 | 第72-83页 |
| 2.1 sgRNA的设计与鉴定 | 第72-75页 |
| 2.1.1 sgRNA设计 | 第72页 |
| 2.1.2 sgRNA体外转录 | 第72-74页 |
| 2.1.3 PCR扩增底物DNA | 第74页 |
| 2.1.4 sgRNA体外切割效率验证 | 第74-75页 |
| 2.2 MVA上游途径基因敲入 | 第75-81页 |
| 2.2.1 pFG-sgRNA(ES)载体的构建 | 第75-76页 |
| 2.2.2 启动子替换 | 第76-77页 |
| 2.2.3 pFG-sgRNA(ES)-mvaE/S质粒载体的构建 | 第77-78页 |
| 2.2.4 含质粒pFG-sgRNA(ES)-mvaE/S的大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第78-79页 |
| 2.2.5 pFN-Cas9-A转化含质粒pFG-sgRNA(ES)-mvaE/S的大肠杆菌感受态细胞 | 第79页 |
| 2.2.6 基因敲入 | 第79页 |
| 2.2.7 基因敲入鉴定 | 第79-81页 |
| 2.2.8 质粒的清除 | 第81页 |
| 2.3 MVA下游途径基因敲入 | 第81-83页 |
| 2.3.1 pFG-sgRNA(EI)载体的构建 | 第81-82页 |
| 2.3.2 启动子替换 | 第82页 |
| 2.3.3 pFG-sgRNA(EI)-ERG-IDI质粒载体的构建 | 第82页 |
| 2.3.4 MVA下游基因敲入 | 第82页 |
| 2.3.5 基因敲入鉴定 | 第82页 |
| 2.3.6 质粒的清除 | 第82-83页 |
| 3 实验结果 | 第83-86页 |
| 3.1 Cas9体外酶切验证sgRNA效率 | 第83页 |
| 3.2 pFG-sgRNA(ES)-mvaE/S载体的鉴定 | 第83-84页 |
| 3.3 pFG-sgRNA(EI)-ERG-IDI载体的鉴定 | 第84页 |
| 3.4 MVA上游基因敲入鉴定结果 | 第84-85页 |
| 3.5 MVA下游基因敲入鉴定结果 | 第85-86页 |
| 4 本章小结 | 第86-87页 |
| 结论 | 第87-88页 |
| 讨论 | 第88-91页 |
| 参考文献 | 第91-95页 |
| 致谢 | 第95-97页 |
| 硕士期间发表论文及申请专利 | 第97页 |
