| 摘要 | 第5-7页 |
| abstract | 第7-8页 |
| 主要符号表 | 第12-13页 |
| 第一部分 绪论 | 第13-26页 |
| 1. 结核病 | 第13-19页 |
| 1.1 结核病简介 | 第13-15页 |
| 1.1.1 结核分枝杆菌概述 | 第13页 |
| 1.1.2 结核分枝杆菌的特性 | 第13-14页 |
| 1.1.3 结核分枝杆菌的毒力蛋白 | 第14-15页 |
| 1.1.3.1 早期分泌性抗原靶6(ESAT6) | 第14-15页 |
| 1.1.3.2 CFP-10(culture filtrate protein-10) | 第15页 |
| 1.1.3.3 PEE家族 | 第15页 |
| 1.1.3.4 MPT64 | 第15页 |
| 1.1.3.5 Ag85 | 第15页 |
| 1.2 卡介苗概述 | 第15-16页 |
| 1.3 表面蛋白概述 | 第16-17页 |
| 1.4 结核病的诊断方法 | 第17-19页 |
| 1.4.1 结核菌分离培养法 | 第17页 |
| 1.4.2 痰涂片镜检法 | 第17页 |
| 1.4.3 结核菌的快速培养法 | 第17-18页 |
| 1.4.4 聚合酶链式反应(PCR) | 第18页 |
| 1.4.5 免疫学诊断 | 第18-19页 |
| 1.4.5.1 结核菌素皮肤试验(TST) | 第18页 |
| 1.4.5.2 IFN-γ释放试验 | 第18-19页 |
| 1.4.5.3 血清学诊断 | 第19页 |
| 2. 噬菌体展示技术 | 第19-25页 |
| 2.1 噬菌体简介 | 第19-20页 |
| 2.2 噬菌体展示技术的应用 | 第20-21页 |
| 2.2.1 抗原表位研究 | 第20页 |
| 2.2.2 分子相互作用 | 第20-21页 |
| 2.2.3 开发新型疫苗 | 第21页 |
| 2.2.4 疾病诊断与防治 | 第21页 |
| 2.3 噬菌体随机肽库的构建 | 第21-25页 |
| 2.3.1 噬菌体随机肽库的简介 | 第21-22页 |
| 2.3.2 辅助噬菌体M13KO7 | 第22页 |
| 2.3.3 噬菌粒载体pCANTAB5E载体 | 第22-23页 |
| 2.3.4 噬菌体展示的一般流程 | 第23-24页 |
| 2.3.4.1 文库的构建 | 第23-24页 |
| 2.3.4.2 筛选 | 第24页 |
| 2.3.4.3 克隆的分析 | 第24页 |
| 2.3.5 酶联免疫吸附(ELISA) | 第24-25页 |
| 3. 研究内容、目的及意义 | 第25-26页 |
| 3.1 研究内容及目的 | 第25页 |
| 3.2 研究意义 | 第25-26页 |
| 第二部分 实验研究 | 第26-61页 |
| 1 实验材料,仪器与试剂 | 第26-32页 |
| 1.1 实验菌株和载体 | 第26页 |
| 1.2 引物设计 | 第26页 |
| 1.3 主要仪器与设备 | 第26-27页 |
| 1.4 主要试剂 | 第27页 |
| 1.5 所用培养基及配制 | 第27-29页 |
| 1.6 溶液及其配制 | 第29-32页 |
| 1.6.1 核酸检测电泳相关试剂 | 第29-30页 |
| 1.6.2 SDS-PAGE所用溶液及胶的配制 | 第30-31页 |
| 1.6.3 Bradford法测蛋白质浓度相关试剂配制 | 第31页 |
| 1.6.4 胞外蛋白提取相关试剂 | 第31-32页 |
| 2 实验方法 | 第32-44页 |
| 2.1 细菌的培养 | 第32页 |
| 2.2 七肽库和十二肽库的构建 | 第32-39页 |
| 2.2.1 七肽库和十二肽库的基因克隆 | 第32-33页 |
| 2.2.2 七肽库和十二肽库的基因的回收 | 第33-34页 |
| 2.2.3 七肽库和十二肽库基因的酶切 | 第34页 |
| 2.2.4 七肽库和十二肽库基因双酶切后的回收 | 第34-35页 |
| 2.2.5 噬菌粒pCANTAB 5E的提取 | 第35页 |
| 2.2.6 噬菌粒pCANTAB 5E的酶切 | 第35-36页 |
| 2.2.7 肽库的基因片段与pCANTAB 5E的连接 | 第36-37页 |
| 2.2.8 连接产物的纯化 | 第37页 |
| 2.2.9 大肠杆菌TG1感受态的制备 | 第37-38页 |
| 2.2.10 电转杯的清洗流程 | 第38页 |
| 2.2.11 连接产物的电转化 | 第38页 |
| 2.2.12 七肽库和十二肽库的库容量和多样性的确定 | 第38-39页 |
| 2.3 结核分枝杆菌MTB和卡介苗BCG膜蛋白的提取 | 第39-40页 |
| 2.3.1 膜蛋白的提取 | 第39页 |
| 2.3.2 提取膜蛋白浓度的测定(Bradford法测定蛋白浓度) | 第39-40页 |
| 2.4 肽库的淘选 | 第40-43页 |
| 2.4.1 辅助噬菌体的制备 | 第40页 |
| 2.4.2 噬菌体滴度的测定 | 第40-41页 |
| 2.4.3 噬菌体与肽库的感染 | 第41页 |
| 2.4.4 肽库的淘选 | 第41-43页 |
| 2.4.4.1 靶分子的包被 | 第41-42页 |
| 2.4.4.2 BCG的反筛 | 第42页 |
| 2.4.4.3 反筛后的噬菌体的扩增 | 第42页 |
| 2.4.4.4 第一轮淘选 | 第42-43页 |
| 2.4.4.5 第二轮及第三轮的淘选与扩增 | 第43页 |
| 2.4.4.6 噬菌体单链DNA的提取 | 第43页 |
| 2.4.4.7 测序 | 第43页 |
| 2.5 ELISA检测 | 第43-44页 |
| 3 实验结果 | 第44-61页 |
| 3.1 7肽库和12肽库的构建 | 第44-53页 |
| 3.1.1 肽库基因的PCR扩增的琼脂糖凝胶检测 | 第44-45页 |
| 3.1.2 噬菌粒pCANTAB 5E双酶切的检测 | 第45-46页 |
| 3.1.3 电转化后结果及库容量的测定 | 第46-52页 |
| 3.1.3.1 7肽库的容量测定 | 第46-49页 |
| 3.1.3.2 12肽库的容量测定 | 第49-52页 |
| 3.1.4 测序之后序列比对 | 第52-53页 |
| 3.1.4.1 7肽库序列比对 | 第52页 |
| 3.1.4.2 12肽库序列比对 | 第52-53页 |
| 3.2 淘选结果 | 第53-61页 |
| 3.2.1 H37Rv蛋白与BCG蛋白检测 | 第53页 |
| 3.2.2 H37Rv蛋白与BCG蛋白浓度的检测 | 第53-54页 |
| 3.2.3 淘选结果 | 第54-59页 |
| 3.2.3.1 7肽库的淘选结果 | 第54-55页 |
| 3.2.3.2 12肽库的淘选结果 | 第55页 |
| 3.2.3.3 7肽库淘选完测序 | 第55-57页 |
| 3.2.3.4 12肽库淘选完测序 | 第57-59页 |
| 3.2.4 噬菌体阳性克隆的鉴定 | 第59-61页 |
| 3.2.4.1 7肽库的鉴定 | 第59-60页 |
| 3.2.4.2 12肽库的鉴定 | 第60-61页 |
| 第三部分 讨论与展望 | 第61-63页 |
| 1. 讨论 | 第61-62页 |
| 2. 展望 | 第62-63页 |
| 第四部分 小结 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-70页 |
| 致谢 | 第70页 |
