| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章 前言 | 第11-19页 |
| 1.1 恶性肿瘤细胞特点 | 第11-12页 |
| 1.2 细胞的增殖和迁移、亚细胞定位 | 第12-13页 |
| 1.3 Copines蛋白家族 | 第13-16页 |
| 1.3.1 Copines蛋白家族的发现 | 第13-14页 |
| 1.3.2 Copines蛋白家族的特性 | 第14-15页 |
| 1.3.3 Copines蛋白家族成员的表达分布 | 第15页 |
| 1.3.4 Copines蛋白家族成员与肿瘤的关系 | 第15-16页 |
| 1.4 Copine-8蛋白 | 第16-17页 |
| 1.4.1 Copine-8蛋白的发现 | 第16页 |
| 1.4.2 Copine-8蛋白与疾病的关系 | 第16-17页 |
| 1.4.3 CPNE8基因的特点 | 第17页 |
| 1.4.4 CPNE8基因的表达分析 | 第17页 |
| 1.5 本课题的研究意义 | 第17-19页 |
| 第二章 Copine-8蛋白对肿瘤细胞增殖和迁移的影响 | 第19-36页 |
| 2.1 实验材料 | 第19-20页 |
| 2.1.1 细胞、质粒以及菌株 | 第19页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第19页 |
| 2.1.3 试剂配置 | 第19-20页 |
| 2.1.4 仪器设备及其型号 | 第20页 |
| 2.1.5 其他仪器设备 | 第20页 |
| 2.2 实验方法 | 第20-30页 |
| 2.2.1 细胞的复苏 | 第20-21页 |
| 2.2.2 细胞的换液 | 第21页 |
| 2.2.3 细胞的传代 | 第21页 |
| 2.2.4 细胞的消化 | 第21-22页 |
| 2.2.5 RNA的提取 | 第22页 |
| 2.2.6 RT-PCR获取cDNA | 第22-23页 |
| 2.2.7 CPNE8基因的扩增 | 第23-24页 |
| 2.2.8 基因的回收 | 第24-25页 |
| 2.2.9 质粒的提取 | 第25-26页 |
| 2.2.10 双酶切质粒和目的基因 | 第26-27页 |
| 2.2.11 感受态的制备 | 第27页 |
| 2.2.12 重组载体的构建 | 第27-28页 |
| 2.2.13 重组载体PCR验证 | 第28页 |
| 2.2.14 重组载体酶切验证 | 第28页 |
| 2.2.15 细胞的计数 | 第28-29页 |
| 2.2.16 重组载体转染细胞 | 第29页 |
| 2.2.17 平板单克隆形成实验测细胞的增殖 | 第29页 |
| 2.2.18 Transwell法检测细胞迁移 | 第29-30页 |
| 2.3 结果与分析 | 第30-36页 |
| 2.3.1 细胞内提取RNA | 第30页 |
| 2.3.2 RT-PCR扩增CPNE8 | 第30-31页 |
| 2.3.3 提取pEGFP-N1质粒 | 第31页 |
| 2.3.4 酶切pEGFP-N1质粒和CPNE8基因 | 第31-32页 |
| 2.3.5 重组质粒pEGFP-N1/CPNE8的PCR验证 | 第32页 |
| 2.3.6 重组质粒pEGFP-N1/CPNE8的酶切验证 | 第32-33页 |
| 2.3.7 重组载体pEGFP-N1/CPNE8转染H1299细胞 | 第33-34页 |
| 2.3.8 过表达copine-8蛋白对H1299细胞增殖的影响 | 第34页 |
| 2.3.9 过表达copine-8蛋白对H1299细胞迁移的影响 | 第34-36页 |
| 第三章 Copine-8蛋白的亚细胞定位 | 第36-41页 |
| 3.1 实验材料 | 第36页 |
| 3.1.1 细胞、质粒以及菌株 | 第36页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第36页 |
| 3.1.3 试剂配置 | 第36页 |
| 3.2 实验方法 | 第36-37页 |
| 3.3 结果与分析 | 第37-41页 |
| 3.3.1 重组质粒pEGFP-N1/CPNE8和pEGFP-N1转染293T细胞 | 第37页 |
| 3.3.2 Copine-8蛋白在293T细胞中的亚细胞定位 | 第37-38页 |
| 3.3.3 重组质粒pEGFP-N1/CPNE8和pEGFP-N1转染H1299细胞 | 第38-39页 |
| 3.3.4 Copine-8蛋白在H1299细胞中的亚细胞定位 | 第39-41页 |
| 第四章 Copine-8多克隆抗体制备 | 第41-59页 |
| 4.1 实验材料 | 第41-42页 |
| 4.1.1 细胞、质粒以及菌株 | 第41页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第41页 |
| 4.1.3 试剂配置 | 第41-42页 |
| 4.2 实验方法 | 第42-48页 |
| 4.2.1 GST-copine-8融合蛋白的原核表达 | 第42-43页 |
| 4.2.2 初步确定适合的诱导条件 | 第43页 |
| 4.2.3 GST-copine-8融合蛋白的可溶性分析 | 第43-44页 |
| 4.2.4 可溶性GST-copine-8融合蛋白的亲和层析纯化 | 第44页 |
| 4.2.5 GST-copine-8融合蛋白包涵体的胶回收纯化 | 第44-45页 |
| 4.2.6 胶内酶解GST-copine-8融合蛋白 | 第45页 |
| 4.2.7 质谱鉴定GST-copine-8融合蛋白 | 第45-46页 |
| 4.2.8 Copine-8蛋白多克隆抗体的制备 | 第46页 |
| 4.2.9 间接ELISA法测定copine-8蛋白多克隆抗体的效价 | 第46页 |
| 4.2.10 Copine-8蛋白多克隆抗体的western blotting验证 | 第46-47页 |
| 4.2.11 Copine-8蛋白多克隆抗体的应用 | 第47-48页 |
| 4.3 结果与分析 | 第48-56页 |
| 4.3.1 pGEX-4T-1质粒的提取 | 第48页 |
| 4.3.2 双酶切pGEX-4T-1质粒和CPNE8基因 | 第48-49页 |
| 4.3.3 重组质粒pGEX-4T-1/CPNE8的验证 | 第49-50页 |
| 4.3.4 GST-copine-8融合蛋白诱导表达条件的优化 | 第50-51页 |
| 4.3.5 GST-copine-8融合蛋白的可溶性分析 | 第51-52页 |
| 4.3.6 亲和层析纯化可溶性GST-copine-8融合蛋白 | 第52-53页 |
| 4.3.7 胶回收纯化GST-copine-8融合蛋白包涵体 | 第53页 |
| 4.3.8 GST-copine-8融合蛋白的质谱鉴定 | 第53-54页 |
| 4.3.9 Copine-8多克隆抗体的ELISA检测 | 第54-55页 |
| 4.3.10 Western blotting检测copine-8多克隆抗体 | 第55页 |
| 4.3.11 Copine-8多克隆抗体用于IHC检测 | 第55-56页 |
| 4.4 讨论 | 第56-59页 |
| 4.4.1 Copine-8多克隆抗体的制备 | 第56-57页 |
| 4.4.2 Copine-8蛋白IHC检测 | 第57-59页 |
| 第五章 展望 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-66页 |
| 附录 英汉缩略语名词对照 | 第66-67页 |
| 致谢 | 第67-68页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第68页 |
