| 摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 1 前言 | 第16-23页 |
| 1.1 昆虫的免疫系统 | 第16-17页 |
| 1.2 Toll信号途径和Imd信号途径 | 第17-19页 |
| 1.3 Toll受体的研究进展 | 第19-20页 |
| 1.4 玫烟色棒束孢的研究进展 | 第20-21页 |
| 1.5 DGE测序的研究进展 | 第21-22页 |
| 1.6 小菜蛾的研究 | 第22页 |
| 1.7 本论文的研究目的与意义 | 第22-23页 |
| 1.7.1 本论文的研究目的 | 第22-23页 |
| 1.7.2 本论文的研究意义 | 第23页 |
| 2 实验材料 | 第23-29页 |
| 2.1 供试昆虫和动物 | 第23页 |
| 2.2 质粒与菌株 | 第23页 |
| 2.3 主要仪器设备 | 第23-24页 |
| 2.4 主要试剂药品 | 第24页 |
| 2.5 主要培养基 | 第24-25页 |
| 2.6 主要试剂的配制 | 第25-26页 |
| 2.7 原生质体制备相关溶液的配制 | 第26页 |
| 2.8 SDS-PAGE相关溶液的配制 | 第26-27页 |
| 2.9 蛋白纯化相关溶液的配制 | 第27-28页 |
| 2.10 Western Blot相关溶液的配制 | 第28页 |
| 2.11 酶联免疫(ELISA)相关溶液的配制 | 第28页 |
| 2.12 其他缓冲液 | 第28-29页 |
| 3 实验方法 | 第29-51页 |
| 3.1 小菜蛾DGE的测序方法 | 第29-30页 |
| 3.1.1 实验流程 | 第29-30页 |
| 3.1.2 标准信息分析流程 | 第30页 |
| 3.2 小菜蛾Toll基因的克隆与序列分析 | 第30-39页 |
| 3.2.1 小菜蛾总RNA的提取和检测 | 第30-32页 |
| 3.2.2 小菜蛾Toll基因CDS序列的扩增 | 第32-36页 |
| 3.2.2.1 cDNA的合成 | 第32-33页 |
| 3.2.2.2 引物设计 | 第33页 |
| 3.2.2.3 PCR反应 | 第33页 |
| 3.2.2.4 PCR产物回收 | 第33-34页 |
| 3.2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第34页 |
| 3.2.2.6 PCR产物与pMD18-T载体连接反应 | 第34页 |
| 3.2.2.7 细菌的转化 | 第34-35页 |
| 3.2.2.8 重组质粒的小量提取 | 第35页 |
| 3.2.2.9 重组质粒的酶切鉴定 | 第35-36页 |
| 3.2.2.10 序列比对和分析 | 第36页 |
| 3.2.3 小菜蛾Toll基因全长的获得 | 第36-39页 |
| 3.2.3.1 cDNA 3’和 5’末端的合成 | 第36-37页 |
| 3.2.3.2 RACE引物的设计与合成 | 第37页 |
| 3.2.3.3 RACE PCR | 第37-38页 |
| 3.2.3.4 小菜蛾Toll基因全序列的拼接和生物信息学分析 | 第38-39页 |
| 3.3 小菜蛾Toll基因的原核表达与多克隆抗体制备 | 第39-45页 |
| 3.3.1 小菜蛾Toll基因的原核表达 | 第39-43页 |
| 3.3.1.1 小菜蛾Toll基因表达片段的PCR扩增 | 第39页 |
| 3.3.1.2 质粒的双酶切和回收 | 第39-40页 |
| 3.3.1.3 pGEX4T-1 与Toll基因表达片段的连接 | 第40页 |
| 3.3.1.4 原核表达 | 第40-41页 |
| 3.3.1.5 Western blot检验 | 第41-42页 |
| 3.3.1.6 蛋白的纯化 | 第42-43页 |
| 3.3.2 多克隆抗体的制备 | 第43-45页 |
| 3.3.2.1 多克隆抗体的制备和纯化 | 第43-44页 |
| 3.3.2.2 抗体滴度的测定 | 第44页 |
| 3.3.2.3 多克隆抗体的Western blot检测 | 第44-45页 |
| 3.4 真菌孢子对小菜蛾的致病力 | 第45-46页 |
| 3.4.1 真菌孢子悬浮液的配制 | 第45页 |
| 3.4.2 处理与收集样品 | 第45-46页 |
| 3.5 真菌孢子对小菜蛾Toll基因表达的诱导 | 第46-47页 |
| 3.6 小菜蛾Toll基因的RNAi | 第47-51页 |
| 3.6.1 RNAi靶标片段的选择 | 第47页 |
| 3.6.2 dsRNA表达载体的构建 | 第47-49页 |
| 3.6.3 原生质体的制备 | 第49页 |
| 3.6.4 原生质体的纯化 | 第49页 |
| 3.6.5 原生质体的转化 | 第49-50页 |
| 3.6.6 重组菌株的筛选 | 第50页 |
| 3.6.7 RNAi的实施 | 第50-51页 |
| 4 结果和分析 | 第51-81页 |
| 4.1 DGE数据质量评估 | 第51-55页 |
| 4.1.1 玫烟色棒束孢毒力测定 | 第51页 |
| 4.1.2 DGE测序评估 | 第51-55页 |
| 4.1.2.1 样品与参考基因比对的统计结果 | 第51-52页 |
| 4.1.2.2 测序质量评估 | 第52页 |
| 4.1.2.3 测序饱和度分析 | 第52-53页 |
| 4.1.2.4 测序随机性分析 | 第53-54页 |
| 4.1.2.5 基因覆盖度统计 | 第54-55页 |
| 4.2 DGE数据分析 | 第55-58页 |
| 4.2.1 相关性分析 | 第55页 |
| 4.2.2 差异基因分析 | 第55-56页 |
| 4.2.3 免疫相关基因差异分析 | 第56-58页 |
| 4.3 小菜蛾Toll基因序列的克隆 | 第58-62页 |
| 4.3.1 小菜蛾总RNA的提取 | 第58-59页 |
| 4.3.2 Toll2、Toll5、Toll 11 基因的ORF扩增 | 第59-60页 |
| 4.3.3 Toll 2、Toll 5、Toll 11 基因 5’和 3’端序列的扩增 | 第60-62页 |
| 4.3.3.1 Toll 2 基因 5’和 3’端序列的扩增 | 第60-61页 |
| 4.3.3.2 Toll 5 基因 5’和 3’端序列的扩增 | 第61页 |
| 4.3.3.3 Toll 11 基因 5’和 3’端序列的扩增 | 第61-62页 |
| 4.4 Toll 2、Toll 5、Toll 11 基因全长序列的拼接和分析 | 第62-70页 |
| 4.4.1 Toll 2 基因全长序列的拼接和分析 | 第62页 |
| 4.4.2 Toll 5 基因全长序列的拼接和分析 | 第62-63页 |
| 4.4.3 Toll 11 基因全长序列的拼接和分析 | 第63-70页 |
| 4.5 不同真菌孢子侵染小菜蛾不同时间后对Toll基因表达量的影响 | 第70-75页 |
| 4.5.1 玫烟色棒束孢孢子悬浮液处理小菜蛾 | 第70-72页 |
| 4.5.2 白僵菌孢子悬浮液处理小菜蛾 | 第72-73页 |
| 4.5.3 绿僵菌孢子悬浮液处理小菜蛾 | 第73-75页 |
| 4.6 Toll 2 基因RNAi | 第75-77页 |
| 4.6.1 Toll 2 基因dsRNA的合成 | 第75-76页 |
| 4.6.2 Toll 2 基因dsRNA表达质粒的转染 | 第76-77页 |
| 4.6.2.1 原生质体的制备与纯化 | 第76页 |
| 4.6.2.2 Toll2基因的转染 | 第76-77页 |
| 4.6.3 RNAi的实施 | 第77页 |
| 4.7 Toll 2 基因原核表达及抗血清的制备 | 第77-81页 |
| 4.7.1 Toll 2 基因表达片段的扩增 | 第77-78页 |
| 4.7.2 Toll 2 表达载体的构建 | 第78页 |
| 4.7.3 Toll 2 的蛋白表达 | 第78-79页 |
| 4.7.4 抗血清纯化 | 第79-81页 |
| 5 结论与讨论 | 第81-87页 |
| 5.1 结论 | 第81-82页 |
| 5.2 讨论 | 第82-85页 |
| 5.3 展望 | 第85-86页 |
| 5.4 本研究的创新点 | 第86-87页 |
| 致谢 | 第87-88页 |
| 基金 | 第88-89页 |
| 参考文献 | 第89-93页 |
| 附录Ⅰ pMD18-T Vector map | 第93-94页 |
| 附录Ⅱ pGEX-4T-1 map | 第94-95页 |
| 附录Ⅲ pSilent-1 map | 第95-96页 |
| 附录Ⅳ 引物 | 第96-99页 |
| 附录Ⅴ 硕士期间发表论文 | 第99页 |
