| 致谢 | 第6-8页 |
| 摘要 | 第8-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-34页 |
| 1.1 引言 | 第14-15页 |
| 1.2 蛋白质体外复性过程 | 第15-22页 |
| 1.2.1 包涵体的形成 | 第15-17页 |
| 1.2.2 包涵体的分离、纯化与溶解 | 第17页 |
| 1.2.3 蛋白质复性机制 | 第17-20页 |
| 1.2.4 蛋白质体外复性方法 | 第20-22页 |
| 1.3 二硫键氧化还原酶DsbA/DsbC及其在协助蛋白质折叠中的应用 | 第22-27页 |
| 1.3.1 蛋白质二硫键的形成 | 第22页 |
| 1.3.2 二硫键氧化还原酶Dsb家族蛋白 | 第22-23页 |
| 1.3.3 DsbA的结构和性质 | 第23-24页 |
| 1.3.4 DsbC的结构和性质 | 第24-25页 |
| 1.3.5 DsbA/DsbC在协助蛋白质体内外折叠中的应用 | 第25-27页 |
| 1.4 重组组织型纤溶酶原激活剂变异体——Reteplase | 第27-32页 |
| 1.4.1 组织型纤溶酶原激活剂 | 第28-29页 |
| 1.4.2 重组组织型纤溶酶原激活剂变异体 | 第29-30页 |
| 1.4.3 Reteplase包涵体的体外重折叠复性研究现状 | 第30-32页 |
| 1.5 本文研究思路及内容 | 第32-34页 |
| 第二章 重组reteplase包涵体制备及稀释复性研究 | 第34-54页 |
| 2.1 引言 | 第34-35页 |
| 2.2 材料与仪器 | 第35-37页 |
| 2.2.1 质粒与菌株 | 第35页 |
| 2.2.2 工具酶与试剂 | 第35页 |
| 2.2.3 培养基 | 第35-36页 |
| 2.2.4 缓冲液 | 第36页 |
| 2.2.5 实验仪器 | 第36-37页 |
| 2.3 实验方法 | 第37-39页 |
| 2.3.1 重组reteplase表达载体的构建 | 第37-38页 |
| 2.3.2 重组质粒鉴定 | 第38页 |
| 2.3.3 菌种筛选 | 第38页 |
| 2.3.4 菌种保藏 | 第38-39页 |
| 2.3.5 重组reteplase的发酵及诱导表达 | 第39页 |
| 2.3.6 重组reteplase包涵体制备及纯化 | 第39页 |
| 2.3.7 重组reteplase包涵体的溶解变性及重折叠复性 | 第39页 |
| 2.4 分析方法 | 第39-42页 |
| 2.4.1 细胞生长测定 | 第39-40页 |
| 2.4.2 琼脂糖凝胶电泳 | 第40页 |
| 2.4.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第40页 |
| 2.4.4 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 | 第40-41页 |
| 2.4.5 重组reteplase的活性测定 | 第41-42页 |
| 2.4.6 重组reteplase复性过程的高级结构分析 | 第42页 |
| 2.5 结果与讨论 | 第42-53页 |
| 2.5.1 Reteplase表达载体构建与重组质粒鉴定 | 第42-43页 |
| 2.5.2 重组reteplase的发酵 | 第43-45页 |
| 2.5.3 重组reteplase包涵体的分离纯化和溶解 | 第45-46页 |
| 2.5.4 重组reteplase的稀释复性 | 第46-50页 |
| 2.5.5 利用正交试验设计考察高蛋白浓度下reteplase的复性效果 | 第50-52页 |
| 2.5.6 复性reteplase的荧光光谱分析 | 第52-53页 |
| 2.6 本章小结 | 第53-54页 |
| 第三章 固定化DsbA/DsbC协助reteplase包涵体体外复性研究 | 第54-74页 |
| 3.1 引言 | 第54-55页 |
| 3.2 材料与仪器 | 第55-56页 |
| 3.2.1 质粒与菌株 | 第55页 |
| 3.2.2 工具酶与试剂 | 第55页 |
| 3.2.3 培养基 | 第55页 |
| 3.2.4 缓冲液 | 第55-56页 |
| 3.2.5 实验仪器 | 第56页 |
| 3.3 实验方法 | 第56-60页 |
| 3.3.1 重组DsbA/DsbC表达载体的构建 | 第56-57页 |
| 3.3.2 重组质粒鉴定 | 第57页 |
| 3.3.3 菌种筛选 | 第57-58页 |
| 3.3.4 菌种保藏 | 第58页 |
| 3.3.5 重组DsbA/DsbC的发酵及诱导表达 | 第58页 |
| 3.3.6 Ni-NTA亲和层析纯化DsbA/DsbC | 第58页 |
| 3.3.7 DsbA/DsbC的固定化 | 第58-59页 |
| 3.3.8 固定化DsbA/DsbC的稳定性测试 | 第59页 |
| 3.3.9 固定化DsbA/DsbC协助reteplase体外复性 | 第59-60页 |
| 3.4 分析方法 | 第60页 |
| 3.5 结果与讨论 | 第60-73页 |
| 3.5.1 DsbA/DsbC表达载体构建与重组质粒鉴定 | 第60-61页 |
| 3.5.2 重组DsbA/DsbC的发酵 | 第61-64页 |
| 3.5.3 DsbA/DsbC的分离纯化 | 第64-65页 |
| 3.5.4 DsbA/DsbC的固定化及稳定性 | 第65-68页 |
| 3.5.5 固定化DsbA/DsbC协助reteplase体外复性 | 第68-73页 |
| 3.6 本章小结 | 第73-74页 |
| 第四章 固定化DsbC复合层析柱及其协助reteplase包涵体柱上复性研究 | 第74-84页 |
| 4.1 引言 | 第74-75页 |
| 4.2 材料与仪器 | 第75页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第75页 |
| 4.2.2 缓冲液 | 第75页 |
| 4.2.3 实验仪器 | 第75页 |
| 4.3 实验方法 | 第75-77页 |
| 4.3.1 复合层析复性柱的构建 | 第75-76页 |
| 4.3.2 固定化DsbC复合层析柱协助reteplase柱上复性 | 第76-77页 |
| 4.4 分析方法 | 第77页 |
| 4.5 结果与讨论 | 第77-81页 |
| 4.5.1 SEC柱体积对固定化DsbC协助reteplase柱上复性的影响 | 第77-78页 |
| 4.5.2 洗脱流速对固定化DsbC协助reteplase柱上复性的影响 | 第78-79页 |
| 4.5.3 上样方式对固定化DsbC协助reteplase柱上复性的影响 | 第79-80页 |
| 4.5.4 固定化DsbC协助reteplase连续批次柱上复性 | 第80-81页 |
| 4.6 本章小结 | 第81-84页 |
| 第五章 结论与展望 | 第84-88页 |
| 5.1 结论 | 第84-85页 |
| 5.2 展望 | 第85-88页 |
| 参考文献 | 第88-96页 |
| 作者简介 | 第96页 |
