| 中文摘要 | 第1-6页 |
| 英文摘要 | 第6-8页 |
| 目录 | 第8-12页 |
| 第一章 前言 | 第12-27页 |
| ·嗜热微生物与嗜热酶的简介 | 第12-13页 |
| ·嗜热微生物的生态分布与生物群落 | 第12-13页 |
| ·原核嗜热微生物 | 第12-13页 |
| ·真核嗜热微生物 | 第13页 |
| ·极端嗜热微生物 | 第13页 |
| ·嗜热酶 | 第13页 |
| ·海洋极端环境及微生物群落简介 | 第13-17页 |
| ·深海热液区喷口分布及Juan de Fuca洋脊地理位置 | 第14-16页 |
| ·深海热液区喷口微生物群落生态系统 | 第16-17页 |
| ·宏基因组与宏基因组学的概述 | 第17-22页 |
| ·宏基因组学研究方法 | 第17-20页 |
| ·环境样品总DNA的提取 | 第18页 |
| ·宏基因组文库的构建 | 第18-20页 |
| ·载体的选择 | 第19页 |
| ·宿主的选择 | 第19-20页 |
| ·目标基因筛选 | 第20页 |
| ·活性筛选 | 第20页 |
| ·序列筛选 | 第20页 |
| ·宏基因组技术的应用 | 第20-22页 |
| ·微生物活性物质筛选 | 第21-22页 |
| ·微生物多样性及与环境关系的研究 | 第22页 |
| ·糖苷水解酶57家族(GH-57)研究进展 | 第22-24页 |
| ·大肠杆菌原核表达系统 | 第24-25页 |
| ·大肠杆菌 | 第24页 |
| ·大肠杆菌表达系统及表达特性 | 第24-25页 |
| ·本研究的背景与意义 | 第25-27页 |
| 第二章 gh-57单克隆的筛选测序 | 第27-34页 |
| ·材料 | 第27-30页 |
| ·菌株和质粒 | 第27-28页 |
| ·培养基和培养方法 | 第28-29页 |
| ·工具酶和试剂 | 第29页 |
| ·需配试剂溶液 | 第29页 |
| ·主要仪器和设备 | 第29-30页 |
| ·方法 | 第30-32页 |
| ·引物设计 | 第30页 |
| ·单克隆菌株的筛选 | 第30-31页 |
| ·Fosmid质粒提取 | 第31页 |
| ·两端测序获得基因全长 | 第31-32页 |
| ·结果和分析 | 第32-33页 |
| ·含gh-57目的片段的单克隆菌株的获得 | 第32页 |
| ·gh-57基因全长序列的获得 | 第32-33页 |
| ·讨论 | 第33-34页 |
| 第三章 gh-57基因序列分析 | 第34-43页 |
| ·材料与方法 | 第34页 |
| ·gh-57基因序列 | 第34页 |
| ·软件及分析方法 | 第34页 |
| ·结果与分析 | 第34-35页 |
| ·gh-57基因序列及预期编码蛋白分析 | 第34页 |
| ·gh-57基因及预期编码蛋白同源性比较 | 第34-35页 |
| ·GH-57编码蛋白的保守性比较分析 | 第35页 |
| ·GH-57蛋白三级结果模拟 | 第35页 |
| ·讨论 | 第35-43页 |
| 第四章 gh-57基因的克隆表达 | 第43-53页 |
| ·材料 | 第43-46页 |
| ·质粒载体与受体菌株 | 第43-45页 |
| ·工具酶和试剂 | 第45页 |
| ·培养基 | 第45页 |
| ·需配试剂溶液 | 第45-46页 |
| ·方法 | 第46-50页 |
| ·Fosmid质粒提取 | 第46页 |
| ·引物设计及PCR扩增反应 | 第46页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第46-47页 |
| ·gh-57基因的T-vector克隆 | 第47页 |
| ·快速小量制备大肠杆菌感受态及连接产物的转化 | 第47-48页 |
| ·大肠杆菌E.coli JM109感受态的制备:CaCl2法 | 第47-48页 |
| ·连接产物转化E.coli JM109 | 第48页 |
| ·快速菌落PCR鉴定阳性重组子 | 第48页 |
| ·大肠杆菌小量质粒提取及酶切鉴定 | 第48-49页 |
| ·DNA测序和序列拼接 | 第49页 |
| ·胶回收酶切后DNA片段 | 第49-50页 |
| ·gh-57基因重组表达载体的构建 | 第50页 |
| ·结果与分析 | 第50-51页 |
| ·gh-57基因的克隆 | 第50-51页 |
| ·讨论 | 第51-53页 |
| 第五章 gh-57基因的原核表达及重组蛋白检测 | 第53-59页 |
| ·材料与方法 | 第53-56页 |
| ·材料 | 第53-55页 |
| ·受体菌株 | 第53页 |
| ·试剂盒 | 第53页 |
| ·培养基 | 第53页 |
| ·需配置的溶液 | 第53-55页 |
| ·方法 | 第55-56页 |
| ·6×His-GH融合蛋白的诱导表达 | 第55页 |
| ·6×His-GH融合蛋白的提取纯化 | 第55页 |
| ·蛋白含量测定 | 第55-56页 |
| ·SDS-PAGE和Western blot分析 | 第56页 |
| ·结果与分析 | 第56-57页 |
| ·gh-57的原核表达 | 第56-57页 |
| ·GH-57融合蛋白的纯化及检测 | 第57页 |
| ·讨论 | 第57-59页 |
| 第六章 GH-57融合蛋白酶活测定 | 第59-66页 |
| ·材料与方法 | 第59-61页 |
| ·材料 | 第59页 |
| ·菌株 | 第59页 |
| ·试剂 | 第59页 |
| ·需配试剂溶液 | 第59页 |
| ·主要仪器和设备 | 第59页 |
| ·方法 | 第59-61页 |
| ·酶活测定 | 第59-60页 |
| ·pH、温度对酶活的影响 | 第60页 |
| ·温度稳定性的分析 | 第60页 |
| ·二硫苏糖醇对酶活性的影响 | 第60页 |
| ·不同金属离子对酶活性的影响 | 第60-61页 |
| ·底物浓度对酶活的影响以及米氏常数(Km)的测定 | 第61页 |
| ·结果与分析 | 第61-64页 |
| ·GH-57融合蛋白的酶学性质及DTT对酶活性的影响 | 第61-62页 |
| ·阳离子对酶活性的影响 | 第62-63页 |
| ·酶反应动力学曲线 | 第63-64页 |
| ·讨论 | 第64-66页 |
| 全文总结 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-74页 |
| 附录一 probable alpha-amylase glycoside hydrolase family 57[metagenomic library of the Juan de FucaRidge hydrothemal vent]Genbank注册号HQ324240 | 第74-77页 |
| 附录二 porphobilinogen synthase[metagenomic library of the Juan de Fuca Ridge hydrothemal vent]Genbank注册号HQ650840 | 第77-79页 |
| 附录三 缩略语 | 第79-81页 |
| 攻读硕士期间发表的学位论文 | 第81-82页 |
| 致谢 | 第82页 |
