| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 引言 | 第11-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-23页 |
| 1.1 冷应激研究现状 | 第13-14页 |
| 1.1.1 细菌的冷应激 | 第13页 |
| 1.1.2 哺乳动物的冷应激 | 第13-14页 |
| 1.2 细胞应激反应 | 第14-15页 |
| 1.2.1 细胞应激的特点 | 第14-15页 |
| 1.2.2 细胞应激的种类 | 第15页 |
| 1.2.2.1 热应激 | 第15页 |
| 1.2.2.2 应激颗粒 | 第15页 |
| 1.3 自噬 | 第15-18页 |
| 1.4 自噬与CVT的区别 | 第18-20页 |
| 1.5 自噬的功能 | 第20页 |
| 1.6 自噬与ROS | 第20-23页 |
| 第二章 材料与方法 | 第23-44页 |
| 2.1 引言 | 第23页 |
| 2.2 实验主要仪器与材料 | 第23-25页 |
| 2.2.1 细胞系及质粒菌种 | 第23页 |
| 2.2.2 实验主要仪器 | 第23-24页 |
| 2.2.3 药物与抗体 | 第24-25页 |
| 2.2.4 各类试剂及缓冲体系 | 第25页 |
| 2.3 实验步骤与方法 | 第25-44页 |
| 2.3.1 pEGFP-LC3、mCherry-hLC3B、pcDNA3-Beclin1质粒鉴定提取 | 第25-28页 |
| 2.3.1.1 鉴定 | 第25页 |
| 2.3.1.2 小量提取质粒 | 第25-26页 |
| 2.3.1.3 测序 | 第26-27页 |
| 2.3.1.4 扩增 | 第27-28页 |
| 2.3.2 细胞培养及转染 | 第28-29页 |
| 2.3.2.1 ZF4细胞培养、复苏与冻存 | 第28-29页 |
| 2.3.2.2 转染: | 第29页 |
| 2.3.3 beclin1 shRNA质粒的构建 | 第29-36页 |
| 2.3.3.1 shRNA目的序列设计 | 第29-31页 |
| 2.3.3.2 构建beclin1 sh RNA质粒 | 第31-36页 |
| 2.3.3.3 ZF4细胞急性冷刺激策略 | 第36页 |
| 2.3.4 RT-QPCR检测LC3,beclin1 mRNA水平 | 第36-37页 |
| 2.3.4.1 ZF4细胞收集 | 第36页 |
| 2.3.4.2 提取斑马鱼细胞总RNA | 第36-37页 |
| 2.3.4.3 将RNA反转成为cDNA | 第37页 |
| 2.3.4.4 mRNA水平表达差异分析 | 第37页 |
| 2.3.5 细胞存活率统计 | 第37-38页 |
| 2.3.6 冷应激下细胞内ROS检测 | 第38-39页 |
| 2.3.6.1 NAC清除ROS方案 | 第38页 |
| 2.3.6.2 ROS检测步骤 | 第38页 |
| 2.3.6.3 多聚赖氨酸包被盖玻片及细胞爬片 | 第38-39页 |
| 2.3.7 LC3与LysoTracker? Red DND-99 共定位 | 第39页 |
| 2.3.8 LC3与MitoTracker? Green FM共定位 | 第39页 |
| 2.3.9 ZF4细胞内线粒体含量检测 | 第39-40页 |
| 2.3.10 western blot检测LC3与beclin1 | 第40-44页 |
| 2.3.10.1 收集蛋白 | 第40-41页 |
| 2.3.10.2 超声破碎细胞，提取蛋白 | 第41页 |
| 2.3.10.3 蛋白浓度测定 | 第41-42页 |
| 2.3.10.4 Western blot | 第42-44页 |
| 第三章 结果 | 第44-57页 |
| 3.1 质粒测序验证 | 第44-45页 |
| 3.2 低温诱导斑马鱼细胞发生自噬 | 第45-47页 |
| 3.3 自噬特异性药物抑制自噬 | 第47-49页 |
| 3.4 构建beclin1 sh RNA表达载体 | 第49-51页 |
| 3.5 ZF4细胞中过表达beclin1基因 | 第51页 |
| 3.6 低温下自噬与ROS之间的关系研究 | 第51-53页 |
| 3.7 低温下自噬与线粒体关系探讨 | 第53-54页 |
| 3.8 讨论 | 第54-57页 |
| 第四章 结论与展望 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-69页 |
| 致谢 | 第69页 |
