| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4页 |
| 第一章 绪论 | 第8-15页 |
| 1.1 β-丙氨酸的概述 | 第8-10页 |
| 1.1.1 β-丙氨酸的理化性质 | 第8页 |
| 1.1.2 β-丙氨酸的应用 | 第8-9页 |
| 1.1.3 β-丙氨酸的合成方法 | 第9-10页 |
| 1.2 L-天冬氨酸 α-脱羧酶的概述结构、功能及催化机理研究进展 | 第10-12页 |
| 1.2.1 L-天冬氨酸 α-脱羧酶的克隆表达及酶学性质研究 | 第10-12页 |
| 1.2.2 ADC催化机理研究 | 第12页 |
| 1.3 天冬氨酸酶的结构、功能及酶学性质研究 | 第12-13页 |
| 1.4 一釜多酶催化体系概述 | 第13页 |
| 1.5 本课题的立题意义及研究内容 | 第13-15页 |
| 1.5.1 本课题的立题意义 | 第13页 |
| 1.5.2 本课题的研究内容 | 第13-15页 |
| 第二章 材料与方法 | 第15-26页 |
| 2.1 材料 | 第15-18页 |
| 2.1.1 菌种与质粒 | 第15页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第15页 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 | 第15-16页 |
| 2.1.4 培养基 | 第16页 |
| 2.1.5 主要溶液 | 第16-18页 |
| 2.2 L-天冬氨酸酶的表达和纯化方法 | 第18-21页 |
| 2.2.1 PCR引物的设计 | 第18-19页 |
| 2.2.2 质粒的提取 | 第19页 |
| 2.2.3 EcaspA的PCR反应体系和PCR反应条件 | 第19页 |
| 2.2.4 PCR产物的纯化 | 第19页 |
| 2.2.5 重组质粒的构建 | 第19页 |
| 2.2.6 E.coli高效感受态的制备 | 第19-20页 |
| 2.2.7 E.coli感受态热击转化方法 | 第20页 |
| 2.2.8 菌落PCR鉴定阳性重组质粒 | 第20页 |
| 2.2.9 双酶切鉴定阳性重组质粒 | 第20页 |
| 2.2.10 DNA测序检测重组质粒 | 第20页 |
| 2.2.11 目的蛋白EcAspA的诱导表达 | 第20页 |
| 2.2.12 目的蛋白EcAspA的纯化 | 第20-21页 |
| 2.3 谷氨酸棒杆菌来源CgADC的表达和纯化方法 | 第21页 |
| 2.3.1 重组质粒的构建 | 第21页 |
| 2.3.2 目的蛋白CgADC的诱导表达 | 第21页 |
| 2.3.3 目的蛋白的纯化 | 第21页 |
| 2.4 EcAspA的酶学性质的测定 | 第21-22页 |
| 2.4.1 酶活测定方法 | 第21页 |
| 2.4.2 EcAspA酶最适温度的测定方法 | 第21-22页 |
| 2.4.3 EcAspA酶最适pH的测定方法 | 第22页 |
| 2.5 赤拟谷盗来源TcADC的表达和纯化 | 第22-23页 |
| 2.5.1 重组质粒的构建 | 第22页 |
| 2.5.2 赤拟谷盗来源Tc ADC的诱导表达 | 第22页 |
| 2.5.3 赤拟谷盗来源Tc ADC的纯化 | 第22-23页 |
| 2.6 赤拟谷盗来源TcADC的酶学性质的测定 | 第23-24页 |
| 2.6.1 Superdex G200凝胶过滤层析测定TcADC分子量 | 第23页 |
| 2.6.2 TcADC同源建模 | 第23页 |
| 2.6.3 TcADC酶活测定方法 | 第23页 |
| 2.6.4 TcADC酶最适温度的测定方法 | 第23-24页 |
| 2.6.5 TcADC酶最适pH的测定方法 | 第24页 |
| 2.6.6 TcADC酶反应动力学参数的测定 | 第24页 |
| 2.6.7 金属离子对TcADC酶活的影响 | 第24页 |
| 2.6.8 TcADC酶温度稳定性的测定方法 | 第24页 |
| 2.6.9 TcADC酶pH稳定性的测定方法 | 第24页 |
| 2.7 一釜双酶催化体系的建立及优化 | 第24-26页 |
| 2.7.1 EcAspA催化富马酸合成L-天冬氨酸的测定方法 | 第24页 |
| 2.7.2 ADC催化L-天冬氨酸合成 β-丙氨酸的测定方法 | 第24-25页 |
| 2.7.3 一釜双酶催化体系中双酶比例的优化方法 | 第25页 |
| 2.7.4 一釜双酶催化体系中底物浓度的优化方法 | 第25页 |
| 2.7.5 一釜双酶催化体系中pH的优化方法 | 第25-26页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第26-44页 |
| 3.1 EcaspA和CgpanD的重组表达、分离纯化及酶学性质鉴定 | 第26-28页 |
| 3.1.1 EcaspA和CgpanD的表达及纯化 | 第26页 |
| 3.1.2 EcAspA最适pH | 第26-27页 |
| 3.1.3 EcAspA最适温度 | 第27页 |
| 3.1.4 EcAspA酶学常数测定 | 第27-28页 |
| 3.1.5 EcAspA与CgADC酶学性质比较 | 第28页 |
| 3.2 EcAspA/CgADC一釜双酶催化体系的构建和优化 | 第28-32页 |
| 3.2.1 构建双酶串联体系转化富马酸制备 β-丙氨酸 | 第28页 |
| 3.2.2 EcAspA催化富马酸加氨生成L-天冬氨酸 | 第28-29页 |
| 3.2.3 CgADC催化L-天冬氨酸合成 β-丙氨酸 | 第29页 |
| 3.2.4 优化EcAspA/CgADC两酶比例 | 第29-31页 |
| 3.2.5 优化底物富马酸浓度 | 第31-32页 |
| 3.3 赤拟谷盗来源TcADC酶的表达、纯化及酶学性质鉴定 | 第32-39页 |
| 3.3.1 重组质粒pET28a-TcpanD的构建 | 第32-33页 |
| 3.3.2 TcADC重组蛋白在E.coli中的表达 | 第33-34页 |
| 3.3.3 TcADC蛋白的纯化 | 第34-35页 |
| 3.3.4 TcADC的聚体形式分析 | 第35-36页 |
| 3.3.5 TcADC的最适温度 | 第36页 |
| 3.3.6 TcADC的最适pH | 第36页 |
| 3.3.7 TcADC的温度稳定性 | 第36-37页 |
| 3.3.8 TcADC的pH稳定性 | 第37页 |
| 3.3.9 金属离子对TcADC酶活的影响 | 第37-38页 |
| 3.3.10 TcADC的酶学常数测定 | 第38-39页 |
| 3.3.11 TcADC催化L-天冬氨酸生成 β-丙氨酸 | 第39页 |
| 3.4 EcAspA/TcADC一釜双酶催化体系条件优化 | 第39-44页 |
| 3.4.1 优化反应体系pH | 第39-40页 |
| 3.4.2 优化双酶添加比例 | 第40-42页 |
| 3.4.3 一釜双酶体系制备 β-丙氨酸 | 第42-44页 |
| 主要结论与展望 | 第44-45页 |
| 主要结论 | 第44页 |
| 展望 | 第44-45页 |
| 致谢 | 第45-46页 |
| 参考文献 | 第46-49页 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第49页 |
