| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-18页 |
| 第一章 绪论 | 第18-44页 |
| ·脂肪酶简介 | 第18-22页 |
| ·脂肪酶的天然功能及其来源 | 第18-19页 |
| ·脂肪酶的结构及催化功能分析 | 第19-22页 |
| ·有机相酶催化 | 第22-27页 |
| ·手性化合物的拆分 | 第23-24页 |
| ·酶法动力学拆分的原理 | 第24-26页 |
| ·提高有机相酶反应对映体比率的方法 | 第26-27页 |
| ·脂肪酶的重组表达 | 第27-33页 |
| ·天然产酶菌株的不足 | 第27-28页 |
| ·脂肪酶重组表达系统 | 第28-33页 |
| ·脂肪酶的分子改造 | 第33-42页 |
| ·脂肪酶突变文库的构建策略 | 第35页 |
| ·脂肪酶高通量分析方法 | 第35-42页 |
| ·本课题的设计思路及研究内容 | 第42-44页 |
| 第二章 亚罗解脂假丝酵母脂肪酶动力学拆分外消旋α-苯乙胺 | 第44-56页 |
| ·前言 | 第44-45页 |
| ·材料与方法 | 第45-47页 |
| ·材料及设备 | 第45页 |
| ·脂肪酶的制备及固定化 | 第45页 |
| ·假丝酵母脂肪酶催化外消旋α-苯乙胺的酰基化反应 | 第45-46页 |
| ·HPLC分析方法 | 第46-47页 |
| ·转化率和对映体选择性的计算 | 第47页 |
| ·结果与讨论 | 第47-53页 |
| ·反应介质的选择 | 第47-48页 |
| ·有机助剂的选择 | 第48-49页 |
| ·有机助剂浓度的选择 | 第49-50页 |
| ·固定化酶用量及反应时间的影响 | 第50-51页 |
| ·反应温度的影响 | 第51-52页 |
| ·批次反应中固定化酶的使用寿命 | 第52页 |
| ·极性有机助剂对固定化酶使用寿命的影响 | 第52-53页 |
| ·本章小结 | 第53-56页 |
| 第三章 亚罗解脂假丝酵母脂肪酶在枯草芽胞杆菌内的重组表达研究 | 第56-90页 |
| ·引言 | 第56-59页 |
| ·枯草芽胞杆菌内游离型分泌表达质粒的构建 | 第57页 |
| ·枯草芽胞杆菌内新型基因替换方法的建立 | 第57-59页 |
| ·材料与方法 | 第59-73页 |
| ·质粒和菌株 | 第59页 |
| ·实验设备及仪器 | 第59-73页 |
| ·实验结果与讨论 | 第73-88页 |
| ·枯草芽胞杆菌内游离型分泌表达质粒的构建 | 第73-81页 |
| ·枯草芽胞杆菌内新型基因替换方法的建立 | 第81-88页 |
| ·本章小结 | 第88-90页 |
| ·枯草芽孢杆菌内游离质粒表达平台的建立 | 第88页 |
| ·枯草芽孢杆菌内整合型表达平台的建立 | 第88-90页 |
| 第四章 亚罗解脂假丝酵母脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达 | 第90-114页 |
| ·引言 | 第90-91页 |
| ·材料与方法 | 第91-99页 |
| ·菌株与质粒 | 第91页 |
| ·酶、蛋白制剂、生化试剂及常用试剂盒 | 第91页 |
| ·培养基配制 | 第91-92页 |
| ·重组质粒的构建 | 第92-93页 |
| ·毕赤酵母感受态的制备及转化 | 第93-94页 |
| ·毕赤酵母重组子的筛选 | 第94-95页 |
| ·产酶重组毕赤酵母的高密度培养 | 第95-96页 |
| ·酶活的测定 | 第96页 |
| ·蛋白含量的测定 | 第96页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第96页 |
| ·重组假丝酵母脂肪酶的纯化 | 第96-97页 |
| ·酵母基因组的提取 | 第97页 |
| ·Southern blot印迹杂交 | 第97-99页 |
| ·实验结果与讨论 | 第99-113页 |
| ·重组质粒的分离纯化及酶切线性化 | 第99-100页 |
| ·重组质粒转化毕赤酵母表达宿主 | 第100页 |
| ·MM-罗丹明平板酶活性筛选 | 第100页 |
| ·重组酵母产酶的摇瓶复筛 | 第100-101页 |
| ·最佳诱导温度的确定 | 第101-102页 |
| ·5 升发酵罐内毕赤酵母重组子发酵产酶实验 | 第102-103页 |
| ·重组脂肪酶YILip2的分离纯化 | 第103-105页 |
| ·重组毕赤酵母多拷贝子的筛选 | 第105-108页 |
| ·多拷贝菌株在5升发酵罐内产酶实验 | 第108-109页 |
| ·分子印迹杂交分析 | 第109-113页 |
| ·本章小结 | 第113-114页 |
| 第五章 分子定向进化及半理性设计提高假丝酵母脂肪酶热稳定性 | 第114-136页 |
| ·引言 | 第114-115页 |
| ·材料与方法 | 第115-120页 |
| ·菌株及质粒 | 第115页 |
| ·易错PCR | 第115-116页 |
| ·定点突变 | 第116-118页 |
| ·点饱和突变 | 第118-119页 |
| ·毕赤酵母感受态制备及电转化 | 第119页 |
| ·重组毕赤酵母在96微孔板培养及产酶诱导 | 第119页 |
| ·热稳定性突变酶筛选方法 | 第119-120页 |
| ·B-FIT实验方法 | 第120页 |
| ·假丝酵母脂肪酶的纯化 | 第120页 |
| ·酶促反应动力学参数的检测 | 第120页 |
| ·实验结果与讨论 | 第120-134页 |
| ·利用分子定向进化技术提高脂肪酶热稳定性 | 第121-126页 |
| ·半理性设计方法提高脂肪酶热稳定性 | 第126-131页 |
| ·定点组合突变及热稳定性脂肪酶的鉴定 | 第131-134页 |
| ·本章小结 | 第134-136页 |
| 第六章 结论与建议 | 第136-138页 |
| 参考文献 | 第138-148页 |
| 附录 | 第148-152页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第152-154页 |
| 致谢 | 第154-156页 |
| 导师和作者简介 | 第156-158页 |
| 附件 | 第158-159页 |
