| 致谢 | 第1-6页 |
| 中文摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 序 | 第10-18页 |
| 1 引言 | 第18-21页 |
| 2 第一章 甲型流感病毒在A549细胞中有效复制并激活PI3K/Akt信号通路 | 第21-42页 |
| ·实验材料 | 第22-24页 |
| ·细胞株及病毒株 | 第22页 |
| ·主要溶液的配制 | 第22页 |
| ·主要工具酶及试剂 | 第22页 |
| ·主要耗材 | 第22-23页 |
| ·主要仪器 | 第23-24页 |
| ·实验方法 | 第24-32页 |
| ·细胞培养 | 第24页 |
| ·MDCK及A549细胞传代培养 | 第24页 |
| ·用LY294002处A549细胞 | 第24页 |
| ·细胞复苏及冻存 | 第24页 |
| ·病毒培养 | 第24-27页 |
| ·流感病毒PR8株的细胞培养 | 第24-25页 |
| ·病毒TCID50测定(组织半数感染量) | 第25-26页 |
| ·流感病毒感染A549细胞 | 第26-27页 |
| ·流感病毒感染后各种蛋白表达水平和磷酸化水平的检测 | 第27-29页 |
| ·流感病毒感染A549细胞 | 第27页 |
| ·细胞总蛋白的提取 | 第27页 |
| ·聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE) | 第27-28页 |
| ·蛋白免疫印迹(Western-blot) | 第28-29页 |
| ·细胞间接免疫荧光 | 第29页 |
| ·LY294002处理后蛋白表达水平和磷酸化水平的检测 | 第29-30页 |
| ·抑制剂的使用 | 第29页 |
| ·流感病毒感染A549细胞 | 第29页 |
| ·细胞总蛋白的提取 | 第29-30页 |
| ·蛋白免疫印迹(western-blot) | 第30页 |
| ·细胞间接免疫荧光 | 第30页 |
| ·统计分析 | 第30-32页 |
| ·实验结果 | 第32-41页 |
| ·流感病毒在A549细胞中的复制 | 第32-34页 |
| ·甲型流感病毒激活了PI3K/Akt信号通路 | 第34-35页 |
| ·LY294002阻断了流感病毒病毒感染造成的PI3K/Akt激活 | 第35-36页 |
| ·LY294002抑制了流感病毒在A549细胞中的增殖 | 第36-38页 |
| ·PI3KAkt通路对流感病毒感染过程的影响不依赖于Raf-1的磷酸化 | 第38-41页 |
| ·讨论 | 第41-42页 |
| 3 第二章PI3KJAkt通路下游分子对甲型流感病毒诱导细胞凋亡的影响 | 第42-77页 |
| ·实验材料 | 第44-47页 |
| ·细胞株及病毒株 | 第44页 |
| ·引物和干扰RNA | 第44-45页 |
| ·主要溶液的配制 | 第45页 |
| ·主要工具酶及试剂 | 第45页 |
| ·试剂盒 | 第45页 |
| ·主要耗材 | 第45-46页 |
| ·主要仪器 | 第46-47页 |
| ·实验方法 | 第47-55页 |
| ·细胞培养 | 第47页 |
| ·病毒培养 | 第47页 |
| ·Mdm2、GSK-3β、mTOR基因沉默 | 第47-51页 |
| ·真核细胞siRNA转染 | 第47页 |
| ·细胞总RNA的提取 | 第47-48页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第48页 |
| ·半定量RT-RCR | 第48-49页 |
| ·细胞总蛋白的提取 | 第49-50页 |
| ·聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE) | 第50-51页 |
| ·蛋白免疫印迹(Western-blot) | 第51页 |
| ·细胞凋亡的检测 | 第51-53页 |
| ·Caspase-Glo 3/7检测细胞凋亡 | 第51-52页 |
| ·流式细胞术 | 第52-53页 |
| ·细胞活力测定(CCK-8法) | 第53页 |
| ·Mdm2亚细胞定位的检测 | 第53-54页 |
| ·流感病毒感染以及细胞处理 | 第53页 |
| ·细胞间接免疫荧光 | 第53-54页 |
| ·统计分析 | 第54-55页 |
| ·实验结果 | 第55-74页 |
| ·mTOR在流感病毒感染过程对细胞凋亡和病毒增殖的影响 | 第55-60页 |
| ·转染mTOR siRNA降低了mTOR的表达水平 | 第55-56页 |
| ·转染mTOR siRNA增强了流感病毒造成的细胞凋亡 | 第56-59页 |
| ·转染mTOR siRNA降低了A549细胞的活力 | 第59页 |
| ·转染mTOR siRNA降低了A549细胞上清中的病毒滴度 | 第59-60页 |
| ·GSK-3β在流感病毒感染过程中对细胞凋亡和病毒增殖的影响 | 第60-67页 |
| ·转染GSK-3β siRNA降低了GSK-3β的表达水平 | 第61-62页 |
| ·转染GSK-3β siRNA增强了流感病毒造成的细胞凋亡 | 第62-65页 |
| ·转染GSK-3β siRNA降低了A549细胞的活力 | 第65-66页 |
| ·转染GSK-3β siRNA降低了A549细胞上清的病毒滴度 | 第66-67页 |
| ·Mdm2在流感病毒感染过程中对细胞凋亡和病毒增殖的影响 | 第67-74页 |
| ·Mdm2分子在流感病毒感染过程中亚细胞定位变化 | 第67-68页 |
| ·转染mdm2 siRNA降低了mdm2的表达水平 | 第68-69页 |
| ·转染mdm2 siRNA降低了流感病毒诱导的细胞凋亡 | 第69-71页 |
| ·转染mdm2 siRNA提高了A549细胞的活力 | 第71-72页 |
| ·转染mdm2 siRNA提高了A549细胞上清中的病毒滴度 | 第72-74页 |
| ·讨论 | 第74-77页 |
| 4 第三章mTOR介导的翻译起始调控与甲型流感病增殖 | 第77-103页 |
| ·实验材料 | 第78-81页 |
| ·细胞株及病毒株 | 第78页 |
| ·细菌菌株 | 第78页 |
| ·质粒载体 | 第78页 |
| ·引物和干扰RNA | 第78页 |
| ·主要溶液的配制 | 第78页 |
| ·主要工具酶及试剂 | 第78-79页 |
| ·试剂盒 | 第79页 |
| ·主要耗材 | 第79页 |
| ·DNA合成和测序 | 第79-80页 |
| ·主要仪器 | 第80-81页 |
| ·实验方法 | 第81-90页 |
| ·细胞培养 | 第81页 |
| ·病毒培养 | 第81页 |
| ·常规分子生物学实验方法 | 第81页 |
| ·质粒的小量提取 | 第81-82页 |
| ·DH5α 感受态细胞的制备方法 | 第82页 |
| ·CaCl_2法转化DNA | 第82-83页 |
| ·LY294002和Rapamycin处理A549细胞 | 第83页 |
| ·流感病毒感染后各种蛋白表达水平和磷酸化水平的检测 | 第83-84页 |
| ·流感病毒感染A549细胞 | 第83页 |
| ·细胞总蛋白的提取 | 第83页 |
| ·蛋白免疫印迹(western-blot) | 第83页 |
| ·细胞间接免疫荧光 | 第83-84页 |
| ·LY294002或Rapamycin处理后蛋白表达水平和磷酸化水平的检测 | 第84-85页 |
| ·抑制剂的使用 | 第84页 |
| ·流感病毒感染A549细胞 | 第84页 |
| ·细胞总蛋白的提取 | 第84页 |
| ·蛋白免疫印迹(western-blot) | 第84-85页 |
| ·细胞间接免疫荧光 | 第85页 |
| ·NS1表达质粒的构建 | 第85-87页 |
| ·流感病毒PR8株NS1基因的克隆 | 第85-86页 |
| ·PCR产物的回收纯化 | 第86页 |
| ·NS1基因片段与表达载体末端的限制性酶切 | 第86-87页 |
| ·NS1基因片段与表达载体片段的连接 | 第87页 |
| ·重组质粒的转化以及鉴定 | 第87页 |
| ·外源表达NS1以及相关蛋白磷酸化水平的检测 | 第87-88页 |
| ·表达质粒pcDNA3.1/NS1-His的转染 | 第87页 |
| ·转染后细胞总蛋白的提取 | 第87页 |
| ·蛋白免疫印迹(western-blot) | 第87-88页 |
| ·各种不同处理后检测流感病毒的增殖水平 | 第88-89页 |
| ·LY294002和Rapamycin处理A549细胞 | 第88页 |
| ·mTOR siRNA转染A549细胞 | 第88页 |
| ·细胞总蛋白的提取 | 第88页 |
| ·蛋白免疫印迹(western-blot) | 第88页 |
| ·细胞间接免疫荧光 | 第88-89页 |
| ·病毒滴度测定 | 第89页 |
| ·统计分析 | 第89-90页 |
| ·实验结果 | 第90-100页 |
| ·甲型流感病毒感染对mTOR下游分子的影响 | 第90-92页 |
| ·流感病毒感染对p70S6K磷酸化的影响 | 第90-91页 |
| ·流感病毒感染引起了4E-BP1的磷酸化 | 第91-92页 |
| ·特异性抑制剂对p70S6K和4E-BP1磷酸化以及NP蛋白表达的影响 | 第92-96页 |
| ·LY294002阻断了流感病毒引起的4E-BP1磷酸化 | 第92-93页 |
| ·流感病毒引起的4E-BP1磷酸化对Rapamycin不敏感 | 第93-96页 |
| ·Rapamycin对流感病毒在A549细胞中的增殖的影响 | 第96-97页 |
| ·外源表达NS1蛋白激活PI3K/Akt通路并磷酸化4E-BP1 | 第97-100页 |
| ·NS1表达质粒pcDNA3.1/NS1-His的构建 | 第97-98页 |
| ·NS1蛋白的外源表达激活了PI3K/Akt信号通路并使4E-BP1磷酸化 | 第98-100页 |
| ·讨论 | 第100-103页 |
| 5 结论 | 第103-105页 |
| ·流感病毒PR8株在A549细胞中高效复制并激活PI3K/Akt信号通路 | 第103页 |
| ·LY294002和Rapamycin抑制了流感病毒在A549细胞中的增殖 | 第103页 |
| ·流感病毒NS1蛋白通过PI3K/Akt信号通路使4E-BP1磷酸化并可能影响了流感病毒早期蛋白NP的表达 | 第103页 |
| ·在A549细胞中Rapamycin对4E-BP1和p70S6K存在不同调控作用 | 第103-104页 |
| ·mTOR抑制了甲型流感病毒诱导的细胞凋亡 | 第104页 |
| ·GSK-3β抑制了甲型流感病毒诱导的细胞凋亡 | 第104页 |
| ·Mdm2促进了甲型流感病毒诱导的细胞凋亡 | 第104-105页 |
| 6 文献综述 | 第105-130页 |
| ·流感病毒简述 | 第105-115页 |
| ·流感病毒的分子结构与致病基础 | 第106-110页 |
| ·RNA聚合酶复合体 | 第107页 |
| ·凝素(Hemagglutinin,HA)的结构和功能 | 第107页 |
| ·核蛋白(Nucleoprotein,NP) | 第107-108页 |
| ·神经氨酸酶(Neuraminidase,NA) | 第108页 |
| ·基质蛋白(Matrix Protein) | 第108-109页 |
| ·非结构蛋白(Non-structural Protein) | 第109-110页 |
| ·流感病毒的复制周期及影响因素 | 第110-115页 |
| ·流感病毒的吸附 | 第111页 |
| ·流感病毒的侵入、内吞以及脱壳 | 第111-112页 |
| ·流感病毒基因的转录与复制 | 第112-113页 |
| ·流感病毒RNP的出核 | 第113-114页 |
| ·流感病毒的装配和释放 | 第114-115页 |
| ·磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)信号通路简述 | 第115-123页 |
| ·PI3K信号通路 | 第115-116页 |
| ·PI3K/Akt信号通路的主要下游信号分子 | 第116-117页 |
| ·PI3K/Akt信号通路在细胞存活与细胞凋亡中的作用 | 第117-119页 |
| ·PI3K/Akt信号通路在蛋白翻译控制与细胞增殖中的作用 | 第119-121页 |
| ·PI3K/Akt信号通路在病毒感染中的作用 | 第121-123页 |
| ·流感病毒感染引起的宿主细胞信号传导 | 第123-128页 |
| ·流感病毒组分识别与宿主先天免疫应答 | 第123-125页 |
| ·双链RNA依赖蛋白激酶(PKR)以及下游信号 | 第123-124页 |
| ·Toll样受体(TLRs)以及下游信号 | 第124页 |
| ·维甲酸诱导基因Ⅰ样受体(RLRs)以及下游信号 | 第124-125页 |
| ·病毒蛋白引起的下游信号 | 第125页 |
| ·参与流感病毒入侵与内吞的信号通路 | 第125-126页 |
| ·参与流感病毒RNP输出及病毒蛋白翻译控制的信号通路 | 第126-127页 |
| ·Raf/MEK/ERK信号通路与病毒核蛋白的输出 | 第126页 |
| ·真核翻译起始因子4E(eIF4E)与病毒蛋白翻译 | 第126-127页 |
| ·PI3K信号通路与流感病毒感染 | 第127-128页 |
| ·PI3K/Akt信号通路与流感病毒引起的细胞凋亡 | 第127页 |
| ·PI3K/Akt信号通路与病毒增殖 | 第127-128页 |
| ·流感病毒与宿主相互作用的复杂性 | 第128页 |
| 结语 | 第128-130页 |
| 参考文献 | 第130-142页 |
| 附录A | 第142-144页 |
| 附录B | 第144-147页 |
| 附录C | 第147-151页 |
| 索引 | 第151-152页 |
| 作者简历 | 第152-154页 |
| 学位论文数据集 | 第154页 |
