| 第一章 引言 | 第1-22页 |
| 1 国内外研究现状 | 第12-20页 |
| 1．1 猪戊型肝炎研究进展 | 第12-18页 |
| 1．2 核酸疫苗研究 | 第18-19页 |
| 1．3 噬菌体展示技术 | 第19-20页 |
| 2．目前存在的问题 | 第20-21页 |
| 3 本研究的目的和意义及技术路线 | 第21-22页 |
| 第二章 研究报告 | 第22-71页 |
| 试验一 黑龙江省猪群戊型肝炎病毒流行及感染猪排毒监测 | 第22-28页 |
| 1 材料方法 | 第22-24页 |
| 1．1 样本 | 第22页 |
| 1．2 试剂 | 第22-23页 |
| 1．3 引物、载体和菌株 | 第23页 |
| 1．4 阳性猪场选择 | 第23页 |
| 1．5 RT-PCR检测猪粪样中戊型肝炎病毒RNA | 第23-24页 |
| 1．6 感染HEV猪的确定 | 第24页 |
| 1．7 隔离饲养及HEV感染猪排毒监测 | 第24页 |
| 1．8 阳性血清和阴性血清的采集 | 第24页 |
| 2．结果 | 第24-26页 |
| 2．1 RT-PCR检测结果 | 第24页 |
| 2．2 检测猪场HEV感染情况及阳性猪场不同年龄检测情况 | 第24-25页 |
| 2．3 HEV感染猪的确定及隔离饲养 | 第25-26页 |
| 2．4 阳性血清与阴性血清的采集 | 第26页 |
| 3 讨论 | 第26-28页 |
| 试验二 DQ01部分结构蛋白片段的表达及其免疫学特征鉴定 | 第28-37页 |
| 1．材料 | 第28-29页 |
| 1．1 质粒、表达载体和菌株 | 第28页 |
| 1．2 试剂 | 第28-29页 |
| 1．3．猪抗HEV阳性血清 | 第29页 |
| 1．4 免疫学器材 | 第29页 |
| 2方法 | 第29-32页 |
| 2．1 结构蛋白分析及引物合成 | 第29页 |
| 2．2 Ag1表达和抗原性鉴定 | 第29-31页 |
| 2．3 以DQ01Ag01为包被抗原的ELISA方法建立 | 第31-32页 |
| 3、结果： | 第32-36页 |
| 3．1 选择核酸片段抗原性分析 | 第32-33页 |
| 3．2 PCR结果 | 第33页 |
| 3．3 SDS-PAGE分析原核表达结果 | 第33页 |
| 3．4 纯化蛋白含量测定及ELISA免疫反应性 | 第33页 |
| 3．5 Western blot鉴定结果 | 第33-35页 |
| 3．6 封闭剂选择 | 第35页 |
| 3．7 纯化蛋白与血清作用条件选择 | 第35页 |
| 3．8 建立的ELISA方法与RT-PCR检测结果的比较 | 第35-36页 |
| 4．讨论 | 第36-37页 |
| 试验三 猪HEV DQ01 ORF2核酸疫苗的构建 | 第37-56页 |
| 1 材料 | 第38页 |
| 1．1 载体、感受态细胞和质粒 | 第38页 |
| 1．2 转染细胞及试验小鼠 | 第38页 |
| 1．3 试剂及主要检测设备 | 第38页 |
| 2 试验方法 | 第38-44页 |
| 2．1 引物设计及合成 | 第38-39页 |
| 2．2 片段的扩增及纯化回收 | 第39-40页 |
| 2．3 拼接顺序 | 第40页 |
| 2．4 拼接片段测序 | 第40页 |
| 2．5 DQ01结构蛋白编码基因的系统进化分析及编码蛋白同源性分析 | 第40页 |
| 2．6 核酸疫苗引物设计及DQ01ORF2插入片段制备 | 第40-41页 |
| 2．7 核酸疫苗构建 | 第41-43页 |
| 2．8 重组质粒对Bal B／C小鼠的免疫及抗体检测 | 第43-44页 |
| 3 结果 | 第44-53页 |
| 3．1 SOE-PCR拼接片段的扩增 | 第44-45页 |
| 3．2 拼接产物测序与原ORF2比较 | 第45-51页 |
| 3．3 DQ01ORF2与我国、日本和美国发表的戊型肝炎病毒ORF2比较 | 第51-52页 |
| 3．4 DQ01ORF2片段的制备 | 第52-53页 |
| 3．5 重组pDQ01ORF2鉴定及测序 | 第53页 |
| 3．6 转染用质粒及免疫用质粒的提取 | 第53页 |
| 3．7 休克时间的确定 | 第53页 |
| 3．8 间接免疫荧光反应结果 | 第53页 |
| 3．9 pDQ01ORF2免疫小鼠结果 | 第53页 |
| 4 讨论： | 第53-56页 |
| 试验四 HEV DQ01 ORF2特异性噬菌体展示肽库的构建 | 第56-71页 |
| 1 材料 | 第57页 |
| 1．1 质粒、噬菌体与菌 | 第57页 |
| 1．2 试剂 | 第57页 |
| 2 方法 | 第57-65页 |
| 2．1 DQ01ORF2随机片段的制备 | 第57-58页 |
| 2．2．噬菌粒载体的制备 | 第58-59页 |
| 2．3 重组噬菌粒的制备 | 第59页 |
| 2．4 电击转化感受态细胞的制备 | 第59页 |
| 2．5 电击转化条件确定 | 第59-61页 |
| 2．6 连接产物的电击转化 | 第61-65页 |
| 3 结果： | 第65-68页 |
| 3．1 DQ01随机片段的制备结果 | 第65-66页 |
| 3．2 载体噬菌粒pC89处理结果 | 第66页 |
| 3．3 电击转化条件的确定 | 第66页 |
| 3．4 连接产物的电击转化结果 | 第66页 |
| 3．5 转化子随机性与大小的确定 | 第66-67页 |
| 3．6 淘洗的产率 | 第67-68页 |
| 4 讨论 | 第68-71页 |
| 1．影响库容量的因素 | 第68-69页 |
| 2．噬菌体与噬菌粒 | 第69页 |
| 3．淘洗用血清的影响 | 第69-71页 |
| 结论 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-87页 |
| 致谢 | 第87-88页 |
| 作者简介 | 第88页 |
